动物基因组DNA与RNA提取.pptVIP

实验一 动物基因组DNA和RNA的提取;二、实验原理;核酸的理化性质;分离纯化核酸总的原则：;核酸制备时应注意的事项: ; 降低温度，改变pH及盐的浓度，都利于对核酸酶活性的抑制，但均不如利用核酸酶抑制剂更有利，当然，几个条件并用更好。 对于DNA，抑制DNase活力很容易，但防止机械张力拉断则更重要。 对于RNA，因分子较小，不易被机械张力拉断，但抑制RNase活力较难，故在RNA提取中设法抑制RNase更重要。;DNase抑制 ①加入少量金属离子螯合剂，如0.01 mol/L EDTA或柠檬酸钠，DNase基本可以全部失活。 ②去垢剂、蛋白变性剂及DNase抑制剂也可使DNase失活。;RNase抑制 ①操作要带手套。 ②所有器皿要严格消毒， ③试剂处理 ④低温操作 ⑤在分离过程中要加入一定的RNase抑制剂。 ; 常用的RNA酶抑制剂 ;核酸制备中常用的去垢剂 核酸本身带负电荷，结合带正电荷的蛋白质。用于核酸提取的去垢剂，一般都是阴离子去垢剂。 去垢剂的作用： 1．溶解膜蛋白及脂肪，使细胞膜破裂； 2．溶解核糖体上面的蛋白质，使其解聚，将核酸释放出来； 3．对RNase、DNase有一定的抑制作用。; 作用： 1.使蛋白质变性、沉淀，从核酸提取液中分离除去，以防造成蛋白污染。 2.使蛋白质变性，故可使核糖体解聚释放出核酸。 3.某些蛋白质变性剂也有抑制 RNase活性和破裂细胞的作用。 ;核酸制备中常用的酶 DNase:降解DNA RNase：降解RNA 蛋白酶K：降解蛋白质 溶菌酶：破碎细胞 ;3. 核酸制备的一般步骤： ;1）破碎细胞（防止核酸酶的作用） 微生物：溶菌酶、SDS裂解。 高等植物：捣碎器破碎、液氮研磨。 酶法：蛋白酶，如胰蛋白酶， 冰冻法：反复冻融或液氮冻后组织捣碎。 动物：液氮处理后用匀浆器或者研钵破碎。 细胞器DNA：首先纯化细胞器。 以上处理时均要同时加入核酸酶抑制剂;2）破碎抽提核酸除去杂质 首先使脱氧核糖核蛋白、核糖体、病毒的核蛋白与其它成分分离 使核酸与蛋白质分离 除去脂类 多糖的除去; 3）核酸的纯化 根据所需核酸的性质和特点除去其它核酸污染,并除去提取过程中的系列试剂(盐、有机溶剂等）杂质，最后得到均一的核酸样品。 ;4）核酸样品的保存 核酸保存的主要条件是温度和介质 温度： 4℃ 样品经常使用 -70℃是长期保存的良好温度，为一次性保存 -20℃保存,避免反复冻融 保存介质： 灭菌水 TE缓冲溶液(最常用)： 10mmol/L Tris-Cl pH8.0 1mmol/L EDTA pH8.0;三、动物基因组DNA的提取;三、动物基因组DNA的提取;三、动物基因组DNA的提取;DNA的提取：苯酚抽提法;1）在500μl抗凝血中加入ligsis buffer 1000μl，充分颠混至清亮。以4000rpm，离心5min。弃上清液。 2）沉淀中加入ligsis buffer 1500μl，充分匀浆。以6000rpm，离心5min 。 3）彻底弃去上清，加入extraction buffer 500μl（裂解细胞），混匀置于37℃，水溶1h 。 4）加入8μl的蛋白酶 K，颠混，37℃过夜（或55℃，3h，但是37℃效果要好些）。 5）每管加入450μl饱和酚（取溶液下层）缓慢摇晃10min，以5500rpm，离心15min。; 6）取上清，每管加入250μl饱和酚和250μl氯仿－异戊醇（24：1），摇匀10min，以5500rpm，离心15min。 7）取上清，每管加入500μl氯仿－异戊醇，摇匀10min，以5500rpm，离心15min。 8）取上清，每管加50μl的3M的NaAC＋，适量无水乙醇（预冷）至满，摇匀放入-20℃保存2h以上。 9）以12000rpm，离心20min。去上清，加入70％乙醇500μl，以12000rpm，离心5min，去上清，50－60℃干燥。 10）加入50μl灭菌去离子水，转弹，混匀。 ;3. 注意事项——材料准备;