ELISA实验必知整理 - 中国实验动物信息网.PDF

手册由中国免疫学实验网( )转自Proteintech Group. 概述1 ELISA 的种类及原理1 直接ELISA2 间接ELISA3 夹心ELISA4 竞争抑制ELISA 7 ELISA 实验的操作 10 将抗原或抗体吸附到固相载体上 10 封闭 12 加入待检样品以及后续试剂 12 温育 12 洗涤去掉游离未结合的反应物 13 加入酶检测底物 13 结果的判读 13 ELISA 实验常用试剂详解 13 ELISA 常见问题及分析 16 手册由中国免疫学实验网( )转自Proteintech Group. 概述 1971 年瑞典的 Engvall 等人分别以纤维素和 苯乙烯试管作为固相载体 吸附抗原/抗体，建立了酶联免疫吸附测定（Enzyme Linked Immunosrbent Assay, 简称 ELISA），后来人们改用板式反应孔进行ELISA，大大地提高了实验通量。 ELISA 实验具有极高的灵活性，实际操作中人们可以根据自己的需要以及手上 已有的材料进行灵活的组合而进行各种可样的 ELISA 进行反应测定，另外 ELISA 实验中的相关试剂和耗材都已经商品化，所以ELISA 被广泛地应用于 生物学的各种研究中。通过ScienceDirect 搜索可以看出，1975 年只有 1 篇文 献是研究ELISA 的，1976 年为6 篇，但是到20 10 年这一数字上升到1994 篇， 历年文献累计达29490 篇，足见其研究之广。 ELISA 的基础是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。结合在固 相载体表面的抗原或抗体仍保持其免疫学活性，酶标记的抗原或抗体既保留其 免疫学活性，又保留酶的活性。在测定时，受检标 （测定抗体或抗原）与固 相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体 复合物与液体中的其他物质分开。再加入酶标记的抗原或抗体，也通过反应而 结合在固相载体上 。此时固相上的酶量与标本中受检物质的量呈一定的比例。 加入酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本中受检物 质的量直接相关，故可根据呈色的深浅进行定性或定量分析。由于酶的催化效 率很高，间接地放大了免疫反应的结果，使测定方法达到很高的敏感度。 ELISA 的种类及原理 关于ELISA 的分类众说纷纭，不同文献从原理或操作上都有不同的分类 意见。这里先将ELISA 分为以下四大类，然后针对每一类进行详细讲解：(1) 直接ELISA；（2 ）间接ELISA；（3 ）夹心ELISA；（4 ）竞争抑制ELISA。其 它的ELISA 都隶属于这四类ELISA 或由这四类ELISA 组合衍生。 1 手册由中国免疫学实验网( )转自Proteintech Group. 直接ELISA 直接ELISA 是所有ELISA 中步骤最简单的一种，其方法是将抗原按一定的 比例用包被缓冲液稀释好包被到固相载体上，包被完成后简单洗涤，再加入封闭 液，封闭结束后再次洗涤除去多余封闭液，加入稀释好的特异性的酶标抗体，37 ℃温育一小时或4℃温育过夜后，洗涤除去多余的抗体，加入底物显色并判读结 果。最后显色的深浅与加入的酶标抗体量成正比。直接ELISA 的原理如图1： 图1 直接ELISA 原理 2 手册由中国免疫学实验网( )转自Proteintech Group. 一个很常见的直接 ELISA 实例就是检测单抗亚型，实际操作中可以将经 过亲和纯化的单抗包被在酶标板上，封闭后加入酶标分型 抗，最后加底物显 色即可。此外用直接ELISA 可以检测血清种属，也有人用直接ELISA 进行单克 隆抗体制备中的初步筛选。不过虽然直接ELISA 操作很简单，步骤也比较简练， 但是其应用范围还是非常有限的，一个重要的原因是这种ELISA 中只经过了