牛布鲁氏菌间接ELISA 抗体检测方法的建立 - 中国农业科学.PDF

中国农业科学 2016,49(9):1818-1825 Scientia Agricultura Sinica doi: 10.3864/j.issn.0578-1752.2016.09.018 牛布鲁氏菌间接ELISA抗体检测方法的建立 1 1,2 1 1 1 1 王 芳 ，冯 宇 ，张 阁 ，蒋 卉 ，朱良全 ，丁家波 1 2 （中国兽医药品监察所检测技术室，北京 100081 ； 山东农业大学动物科技学院，山东泰安 271018 ） 摘要：【目的】建立高通量牛布鲁氏菌间接 ELISA 诊断方法，为科学高效诊断牛布鲁氏菌病提供技术手段。 【方法】以提纯的猪布鲁氏菌 S2 株脂多糖（LPS）作为包被抗原，采用棋盘滴定法确定了抗原包被浓度、包被 液、抗原包被时间、封闭液、样品稀释液、血清稀释倍数、兔抗牛酶标抗体稀释液、兔抗牛酶标抗体稀释浓度、 最佳 TMB 底物反应时间等参数，初步建立了牛布鲁氏菌间接 ELSIA 方法。并用上述条件初步建立的方法对 176 份牛布鲁氏菌病阳性血清和 132 份牛布鲁氏菌病阴性血清进行检测。检测结果经 SPSS17.0 软件分析，构建受试 者工作特征曲线(ROC)及曲线下面积，确定敏感性和特异性；通过 Youden 指数确定阴阳性判定的临界点。使用 质控阴、阳性血清评价试剂盒的批内和批间重复性。用本研究建立的 ELISA 试剂盒及商品化试剂盒同时对临床 上 1 200 份牛血清样本进行比对检测，比较其符合率。【结果】通过棋盘法确定的试剂盒中各组分的最佳条件为： 抗原包被浓度为 10 μg·mL-1 ，最适包被液为碳酸盐缓冲液，最佳包被时间为 2—8℃、16 h，最适血清稀释度 为 1 ﹕50，最佳封闭液为含有 3%明胶的 PBST，最佳样品稀释液为含有 0.5%蔗糖的 PBST，最佳兔抗牛酶标抗体 稀释液为含有 5%马血清的 PBST，最佳兔抗牛酶标抗体工作浓度为 1 ﹕20 000，最佳 TMB 底物反应时间为 15 min。 按上述条件建立的间接 ELISA 方法检测 176 份牛布鲁氏菌病阳性血清和 132 份牛布鲁氏菌阴性血清，并统计结 果后使用 SPSS17.0 软件分析该方法受试者工作特征曲线（ROC）线下面积为 0.98。最佳判定临界点为样本 OD 值/阳性 OD 值（S/P）×100%=20%。在此临界值上时，敏感性为 97.7%，特异性为 95.5%。对 1 200 份临床样本 的比对检测显示，本研究建立的间接 ELISA 方法与进口商品化试剂盒的总符合率为 96.25%。【结论】建立了特 异性和敏感性良好的牛布鲁氏菌间接 ELISA 抗体检测方法。 关键词：布鲁氏菌；间接ELISA；特异性；敏感性 Development of Indirect ELISA for Antibody of Brucella abortus 1 1,2 1 1 1 1 WANG Fang , FENG Yu , ZHANG Ge , JIANG Hui , ZHU Liang-quan , DING Jia-bo 1 2 （Department of Inspection Technology Research, China Institute of Veterinary Drug Contr