DNA加合物检测技术.ppt

DNA加合物检测技术和方法 1、DNA加合物： 一般是指外源或者内源的亲电性的化合物或其代谢产物与亲核性的DNA大分子发生反应而生成的共价加合物，是DNA损伤的一类重要形式。 2、可与DNA发生加合作用的化学物质: 烷化剂，多环芳烃，苯乙烯氧化物，醌类，醛类，抗肿瘤药物，黄曲霉素，N-亚硝基化合物,杂环芳香胺和丙烯酰胺等。 其中的一些化合物具有较强的亲电性，可直接与DNA的碱基反应生成加合物，如醛类化合物； 另外一些化合物需要经过体内的代谢酶活化，产生具有亲电性，活泼的代谢物，进而与DNA的碱基反应形成共价的复合物，即DNA加合物 3、研究DNA加合物的意义： DNA加合物是一类极其重要的生物标志物 作为接触（暴露）生物标志物，反映致癌物到达靶位的实际接触剂量，为监测及分析致癌性化学污染物的暴露提供有效手段； 作为一种效应标志物，反映DNA受到的损伤效应，为生物体的癌症风险评价提供重要信息。 4、检测DNA加合物的技术水平 生物体内DNA加合物的含量非常低，大约为每108个核苷酸中含有 0.1 ～1个加合物； 要求所发展的DNA加合物检测方法的灵敏度应该在每108个核苷酸中能检测出1个加合物的水平上。 5、目前主要的DNA加合物检测方法： 32P-后标记法 免疫毛细管电泳激光诱导荧光法 免疫分析法 液相色谱串联质谱法 毛细管电泳串联质谱法 6、32P-后标记法 32P-后标记法以其高灵敏度（1个加合物/109个核苷酸的水平），低样品（1-10ug）用量且支持空白对照，不需事先制备加合物标样的优点在DNA加合物的检测中占据了重要地位。 它不仅能检测DNA加合物，还能检测多种形式的DNA损伤，是目前应用最为广泛的DNA加合物检测方法。 6.1 原理： (1)采用DNA水解酶将DNA降解为3’-磷酸单核苷酸; (2)在T4多核苷酸激酶的作用下将[γ-32 P]ATP 上的32P标记到单核苷酸的5’端,形成可放射显影的5’-32 PNp3’(正常单核酸)或5’-32 PXNp-3’(含加合物的单核酸) (3)采用多维薄层色谱(TLC)或高效液相色谱(HPLC)分离正常的单核苷酸与含加合物的单核苷酸; (4)对分离得到的含加合物的单核苷酸通过放射自显影技术制成指纹图,液闪计数测定所含加合物的含量。 6.2 标准的32P-后标记法基本步骤 6.3 标准的32P-后标记法具体步骤 6.3.1 DNA加合物样品的制备 动物：用雌性大鼠(SD),采用腹腔注射的施药方式,将有毒物溶液注入大鼠的腹腔中,24h后采集动物各组织样品,迅速冷冻贮存于低温冰箱中. 人体：静脉血样，取待测人群中某时某人的静脉血5ml(加抗凝剂)，尽快(24h之内)提取全血中的淋巴细胞(或白细胞),贮于一70℃的低温冰箱内. 6.3.2 DNA加合物的提取和纯化 动物组织 人血淋巴细胞 组织细胞匀浆 淋巴细胞匀浆 6.3.3 32P-后标记过程 DNA和加合物,加一定量外切酶和内切酶,在适量的酶解缓冲溶液存在下培育2-3h,使DNA完全酶解成2’-脱氧核苷3’-单磷酸(3’-dNmP+3’-dXmP) 用适当量的P1核酸酶37℃培育40min,以除掉大量正常DNA的酶解物 在T4多核苷酸激酶的催化下,γ-32PATP(uCi)和底物(2’-脱氧核苷3’-单磷酸)反应(37℃,30min),生成带放射磷的2’-脱氧核苷3’5’二磷酸酯(3’5’dNDP+3’5’dXDP) 最后加1ul的腺苷三磷酸酶37℃下培育30min,除掉多余的放射磷. 6.3.4 加合物的分离和分辨 依据DNA和DNA加合物的酶解物色谱性能的差异 标记过的DNA加合物的酶解物样品点在ODS一TLC吸附板上(10×10cm) 用相应的展开剂展开,分离加合物与正常核酸 将留在ODS板上的加合物接触转移到PEI一TLC阴离子交换板上, 用不同的展开剂多次多相的展开,将不同的加合物分离分辨开. 6.3.5 自显影和定量 将展好的PEI板进行自显影处理,制出DNA加合物的自显影指纹图.然后将相应的PEI板上的多余斑点(与空白对照)取下,液闪计数定量计算,加合物含量用RAL(相对加合物标记率)表示: 6.4 32P-后标记法的不足 DNA需要经过酶解，操作麻烦，定量准确度差 不同种类、不同结构的加合物的标记效率不一样 依赖各种色谱法进行分离，分离过程漫长，工作量大，自动化程度低 检测的特异性低，难以区分结构类似的DNA 加合物 6.5 32P-后标记法的改良方法 6.5.1 限量ATP法 在标记反应中限