免疫金层析技术快速检测副溶血弧菌方法初步探究.docVIP

免疫金层析技术快速检测副溶血弧菌方法初步探究[摘要] 本研究应用兔抗V.parahaemolyticus IgG-2包被硝酸纤维素膜检测线，羊抗兔IgG包被对照线，胶体金标记兔抗V.parahaemolyticus IgG-1，建立了检测副溶血弧菌（V.parahaemolyticus）的免疫金层析试纸条法（IGCA）。结果表明，阳性者试纸条检测线和对照线均出现红色线，实验过程仅需5～15min即可判断结果，该法对V.parahaemolyticus的最低检测量为3.60×104cfu/mL，与溶藻弧菌、霍乱弧菌、美人鱼弧菌、麦氏弧菌、弗氏枸橼酸杆菌和沙门菌等常见肠道菌不发生交叉反应。将试纸条4℃存放6个月、常温存放3个月，37℃存放1个月，检测结果无差异。说明建立的试纸条检测方法操作简便快速、灵敏度高、特异性强、稳定性好，结果容易观察和判断，非常适于基层养殖部门应用。 [关键词] 副溶血弧菌 胶体金 免疫层析 副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus，简称V.parahaemo- lyticus )最早是由Fujino等[1]于1953年从日本一个食物中毒患者身上初次分离得到的，是一种革兰氏阴性嗜盐菌，常呈多态性，有鞭毛，无荚膜和芽孢。在含3%～5%的食盐培养基中，pH7.5-8.5及37℃条件下，生长最为良好并且对酸敏感。该菌分布于世界各地，通常广泛分布于近海区域、盐湖及鱼、贝类等海产品中，是沿海地区引起食物中毒的重要病原菌，在食物中的数量超过10 6即可导致患者出现腹泻、肠痉挛、恶心、呕吐和头疼等典型胃肠炎反应，严重者可引起败血症甚至死亡，也曾有发烧和发冷的报道，但较少。我国沿海地区每年都有因副溶血性弧菌引起食物中毒的报道。1998年以来的资料显示，副溶血弧菌引发食物中毒的规模呈明显的上升趋势，已超过沙门菌食物中毒，跃居首位[2]。为有效控制副溶血弧菌病原的发生扩散，准确即时的检测手段正是预防控制、传播的关键所在。 目前，V.parahaemolyticus的检测技术主要有传统的细菌分离培养、酶联免疫吸附 (ELISA )法[3]和免疫荧光抗体技术[4]，也有现代的分子生物学检测技术，如环介导等温扩增技术[5]、PCR技术[6-10]、荧光定量PCR技术[11-12]、UPPCR-SSCP技术[13]、变性高效液相色谱（DHPLC）技术[14]和Transcription- reverse transcription concerted(TRC)方法[15]、DNA指纹图谱技术[16]等。但综合来看，以上介绍的各种方法各有其优缺点，在快速检测、定性和精确定量方面难以兼顾。传统方法费时费力，对于需要检测大量样本的出入境检疫、食品、卫生以及兽医部门的实验室是一种沉重的负担，不仅影响检验机构的工作效率，而且使生产部门的产品运输和仓储时间延长，生产成本加大。因此，快速检测方法方面的研究越来越受到关注。 目前快速检测研究主要集中在胶体金试纸条、斑点金渗滤法、免疫荧光技术、酶联免疫吸附试验、PCR和荧光PCR等方法上，其中免疫荧光技术和酶联免疫吸附试验需要一定的操作经验和仪器设备，而分子生物学检测技术，如PCR和荧光PCR，则更需要专业技术和检测经验以及较昂贵的检测设备，难以在口岸一线部门和基层养殖部门推广使用。免疫胶体金技术是20世纪90年代以来继三大标记技术（荧光素、放射性同位素和酶）后发展起来的一项新型体外固相标记免疫诊断技术，具有操作简单、快速、灵敏、可现场操作等优点[17-18]，适应于口岸快速检测的需要。本研究旨在以V.parahaemolyticus为试验材料，制备兔抗副溶血弧菌多克隆抗体，利用先进的胶体金生产工艺来研制检测V.parahaemol- yticus的金标检测试纸条。 1 材料与方法 1.1 仪器与试剂 仪器主要有高速冷冻离心机(Backman)、硝酸纤维素膜（美国Millipore公司）、玻璃纤维膜（上海金标生物科技公司）、吸水纸、透析袋等；试剂均为分析纯，氯金酸（上海市试剂总厂化学试剂一厂产品）、柠檬酸三钠、酪蛋白、牛血清白蛋白、羊抗兔IgG、碳酸钾等，胶体金稀释液（含1％BSA，0.05％PEG20000，5％蔗糖，0.05%Tween-20的0.01mol/L pH7.2的PBS缓冲液）。 1.2 菌株 副溶血弧菌、溶藻弧菌、霍乱弧菌、麦氏弧菌、沙门菌、枸橼酸杆菌各1株，均由厦门出入境检验检疫局技术中心动检实验室提供。 1.3 兔抗副溶血弧菌多克隆抗体的制备与纯化 参照文献[19]中的方法稍作改进，将纯化好的副溶血弧菌接种3.5%碱性蛋白胨水，37℃培养18～24h后，用终浓度为0.3%的甲醛灭活24 h后取少量灭活菌液接种3.5%碱性