ProteinAResin纯化抗血清.doc

Protein A Resin（Cat.No.L00210）纯化抗血清操作程序 实验原理 Protein A亲和层析介质是纯化和分离IgG常用手段。Protein A是一种分离自金黄色葡萄球菌的细胞壁蛋白，主要通过Fc片段结合哺乳动物IgG。天然Protein A有5个IgG结合域和许多其它的未知功能域。重组Protein A包含5个高IgG结合域(Ka=108/M)，并去除了其它非主要结合域以降低非特异性结合。目前，Protein A亲和层析介质已经广泛用于从生物流体或细胞培液中分离纯化各种类型的IgG或者IgG片段。实验已经证明，Protein A和IgG的相互作用仅涉及Fc区域，而不影响Fab片段和抗原的结合。Protein A Resin（Cat.No.L00210）的特性 Resin 体积 5ml（10ml含5ml浆液） 配体 E.coli表达的重组链球菌Protein A 每个配体结合IgG位点的数目 5 配体的分子量 约34kDa 配体的PI 5.17 配体密度 ≈2mg重组蛋白A/mlresin 静态结合能力 大于20mg猪IgG/ml Resin 基质 4%琼脂糖凝胶 颗粒大小 90μm（45-165μm） 储存液 含20%乙醇的1XPBS 储存条件 4-8℃ 有效期 未开封前可保存12个月 实验试剂和器材 2.1实验试剂 Na2HPO4、NaCl、甘氨酸、浓盐酸、Tris、蒸馏水、乙醇 2.2实验器材 Protein A Resin（金斯瑞生物科技 L00210）、4℃冰箱、PH计、锥形瓶、量筒、漏斗、移液器、tip头、试剂瓶、0.μm滤膜、注射器2.3样品 抗血清IgG含量正常范围 7.6～16.6g／L 实验步骤 3.1 溶液配制 3.1.1 结合液/冲洗液的配制 Na2HPO4 2.84g（20mM），NaCl 8.77g（0.15M），加入800ml蒸馏水中，用盐酸调至PH 8.0，补蒸馏水至1000ml，0.μm滤膜过滤，4℃封存备用。 3.1.2 洗脱液的配制 甘氨酸-盐酸缓冲液：0.1M甘氨酸7.057g（0.1M）加入800ml蒸馏水中，用盐酸调至PH 2.5。0.μm滤膜过滤，4℃封存备用。 3.1.3 中和液的配制 Tris-HCl缓冲液:Tris121.14g(1M) 加入800ml蒸馏水中，用盐酸调至PH 8.5。0. μm滤膜过滤，4℃封存备用。 3.2 样品准备 抗血清样品过滤（0.μm滤膜）去除样品中的颗粒杂质加入等体积的结合液/冲洗液稀释3.3 准备纯化柱 3.3.1 预先在新的纯化柱里加入ml结合液/冲洗液，然后将完全混匀的ml （含Protein A Resin 2ml）加入到此柱中。 3.3.2 使Protein A Resin并使结合液/冲洗液顺柱流出。 3.3.3 缓慢加入ml结合液/冲洗液平衡纯化柱，结合液/冲洗液顺柱流出，保持流速约1ml/min。 3.4 样品纯化 3.4.1 缓慢加入样品，保持流速约1ml/min。收集流出溶液，通过SDS电泳检测纯化柱的有效率。 3.4.2 缓慢加入ml结合液/冲洗液平衡纯化柱，保持流速约2ml/min。 3.4.3 缓慢加入ml洗脱液，保持流速约1ml/min。收集包含IgG的洗脱液，并立即加入中和液。IgG洗脱液） 3.5 重生纯化柱 缓慢加入ml洗脱液重生纯化柱，然后加入ml结合液/冲洗液纯化柱。重生后的填料可以重复利用达10次，结合能力不会明显减弱。 3.6 保存将重生的Protein A Resin保存在含20%乙醇的结合液/冲洗液中，4℃-8℃保存备用（勿冷冻）。4 问题与解决方法 4.1 流速太慢（0.5ml/min）。可能原因缓冲液或样品中有小的气泡。解决方法：保证缓冲液和样品中无气泡，勿使纯化柱干燥。 4.2 纯化后抗体未检测到。可能原因抗体浓度太低。解决方法：使用结合了特异抗原的纯化介质。 4.3 抗体效价降低。可能原因抗体对PH值过低的洗脱液敏感。解决方法：洗脱后立即加入中和液中和。 4.4 在任何洗脱液中都未检测到抗体。可能原因IgG的亚类与ProteinA不