凝胶过滤层析gelfiltrationchromatography.docx

凝胶过滤层析 gel filtration chromatogra phy 定义 凝胶过滤层析是生化分离常用色谱技术的一种。 凝胶过滤层析是生化分离常用色谱技术的一种。 利用具有网状结构的凝胶的分子筛作用, 利用具有网状结构的凝胶的分子筛作用,根据被分离 物质的分子大小不同来进行分离，也被称为体积排阻 物质的分子大小不同来进行分离，也被称为体积排阻 层析（size 层析（size exclusion chromatography）、分子筛 chromatography）、分子筛 层析（Molecular 层析（Molecular Sieve Chromatography）、凝胶渗 Chromatography）、凝胶渗 透层析（Gel 透层析（Gel Permeation Chromatography） Chromatography） 应用 凝胶层析法适用于分离和提纯蛋白质、酶、多 肽、激素、多糖、核酸类等物质。 分子大小彼此相差25%的样品，只要通过单一 分子大小彼此相差25%的样品，只要通过单一 凝胶床就可以完全将它们分开。 利用凝胶的分子筛特性，可对这些物质的溶液 进行脱盐、去热源和脱色。 进行脱盐、去热源和脱色。 原理 凝胶是一类多孔性高分子聚合物，每 个颗粒犹如一个筛子。 小分子进入 当样品溶液通过凝胶柱时，相对分子 当样品溶液通过凝胶柱时，相对分子 葡聚糖珠内 质量较大的物质沿着凝胶颗粒间的孔 质量较大的物质沿着凝胶颗粒间的孔 隙，随着溶剂流动，首先流出层析柱； 相对分子质量较小的物质可自由地进 相对分子质量较小的物质可自由地进 大分子不 出凝胶颗粒的网孔，使流量增长，移 能进入珠 内，经珠 动速率慢而最后流出层析柱。 之间缝隙 中等大小的分子在大分子物质与小分 中等大小的分子在大分子物质与小分 流出 子物质之间被洗脱。 这样，经过层析柱，混合物中的各物 质按其分子大小不同而被分离。 带网孔的 葡聚糖珠 固定相（凝胶） 固定相（凝胶） 三维空间网状结构 小分子 样品 流 动 相 大分子 分子筛效应： 分子筛效应： 按分子大小不同, 按分子大小不同,在凝胶受到的 阻滞作用有差异 有差异, 阻滞作用有差异,从而造成各组分在凝 胶柱中的迁移速度不同得到分离。 胶柱中的迁移速度不同得到分离。 小分子 被延滯 固 定 相 较快流出 基本概念 外水体积(Vo)是指凝胶柱中凝胶颗粒周围空间的体积， 外水体积(Vo)是指凝胶柱中凝胶颗粒周围空间的体积，也就是凝胶颗粒 (Vo)是指凝胶柱中凝胶颗粒周围空间的体积 间液体流动相的体积。 间液体流动相的体积。 内水体积(Vi)是指凝胶颗粒中孔穴的体积。 内水体积(Vi)是指凝胶颗粒中孔穴的体积。 (Vi)是指凝胶颗粒中孔穴的体积 基质体积(Vg)是指凝胶颗粒实际骨架体积。 基质体积(Vg)是指凝胶颗粒实际骨架体积。 (Vg)是指凝胶颗粒实际骨架体积 柱床体积 (Vt)就是指凝胶柱所能容纳的总体积。 柱床体积(Vt)就是指凝胶柱所能容纳的总体积。 (Vt)就是指凝胶柱所能容纳的总体积 洗脱体积(Ve) 洗脱体积(Ve)是指将样品中某一组分洗脱下来所需洗脱液的体积 (Ve)是指将样品中某一组分洗脱下来所需洗脱液的体积 凝胶层析柱各种体积示意图（阴影部分） 凝胶层析柱各种体积示意图（阴影部分） 分配系数（Kd） 每个溶质分子在流动相和固定相之间有一个特定的分配系数 Ve=Vo+Kd Ve=Vo+KdVi KdVi Vo， (1)Ve = Vo，Kd = 0 分子完全被排阻于凝胶颗粒之外 全部分布于流动相里 最先流出 Vi， (2)Ve = Vo + Vi，Kd = 1 分子完全不被排阻 完全向凝胶颗粒内部扩散 在两相分配的比值为1, 1,最后流出 在两相分配的比值为1,最后流出 lt;1， (3) 0 lt;Kd lt;1，Ve = Vo +ViKd 为溶质以某种程度向凝胶颗粒内扩 散 特点： 特点：与被分离物质分子的 大小和凝胶颗粒孔隙的大小 有关 Kd=0 大分子量 小分子量 0＜ 0＜Kdlt;1 Kd=1 洗脱体积 典型的凝胶类型 交联葡聚糖凝胶：Sephadex? 交联葡聚糖凝胶：Sephadex? 聚丙烯酰胺凝胶：Sephacryl ? 聚丙烯酰胺凝胶： 琼脂糖凝胶：Sepharose和Bio-Gel? 琼脂糖凝胶：Sepharose和Bio-Gel? 其它：有机凝胶Sepharon Sepharon， 其它：有机凝胶Sepharon，交联聚醚 Toyopeal，纤维素凝胶， To