试验二动物蠕虫学粪便检查技术(二).DOC

实验二 动物蠕虫学粪便检查技术(二) 一、实验目的及要求 1、掌握动物蠕虫学常见的实验室粪便幼虫培养及检查技术。 2、认识线虫幼虫和吸虫毛蚴等寄生虫幼虫的一般形态特征。 二、实验器材 载玻片，盖玻片，平皿，培氏皿，镊子，烧杯，塑料杯，塑料袋，漏斗，漏斗架，胶帽吸管，离心管，试管，玻璃棒，纱布，脱脂棉，粪筛，锦纶筛（260目/英寸），搪瓷缸，三角量筒，三角烧杯，胶塞，表玻璃，酒精灯，平底孵化瓶，贝尔曼氏装置（乳胶管二端分别连接漏斗和小试管），显微镜测微器（目镜测微尺、物镜测微尺），血球计数板，普通温箱，光学显微镜等。 碘液，家畜新鲜粪便等。 三、实验方法、步骤和操作要领（幼虫培养法、毛蚴孵化法、幼虫分离法、寄生虫学测微法） （一）幼虫培养法（Technique for the Culture of Third-stage Larvae） 圆线目中有很多线虫的虫卵在形态结构上非常相似，、难以进行鉴别。有时为了进行科学研究或达到确切诊断目的，可进行第三期幼虫的培养，之后再根据这些幼虫的形态特征进行种类的判定。另外，做人工寄生性线虫感染试验时，也要用到幼虫培养技术。 (图2-1) 幼虫培养的方法很多，这里仅介绍最简单的一种。即：取新鲜粪便若干，弄碎置培养皿中央堆成半球状，顶部略高出，然后在培氏皿内边缘加水少许（如粪便稀可不必加水），加盖盖好使粪与培氏皿接触。放入25～30℃的温箱内培养（夏天放置室内亦可）。每日观察粪便是否干燥，要保持适宜的湿度。约经7～15天，第三期幼虫即可出现（Egg-L1-L2-L3），它们从粪便中出来，爬到培氏皿的盖上或四周。这时，我们可用胶帽吸管吸上生理盐水把幼虫冲洗下来，滴在载玻片上覆以盖片，在显微镜下进行观察。  培养幼虫时如无培氏皿，可用一大一小二个平皿来代替，将小平皿（去掉盖）加上粪便放于大平皿中央，大平皿内加少许水，然后用大平皿盖盖上，即可进行培养。也可用两个塑料杯来培养幼虫，效果更好。即先将一个塑料杯（上大下小）一截为二，较小的底部用针扎许多小孔，装满待培养粪便，上用双层纱布蒙上，再把截下的那部分套上（头向下），使纱布绷紧；然后在另一个塑料杯内加少量水，把需培养的粪便杯套在该杯上（纱布面朝下），外面套上塑料袋进行培养即可。培养好后，用幼虫分离法分离幼虫。即把装粪便的小杯放在分离装置的漏斗上（用三角量筒也可），同时把塑料杯内的水也倒入（用水冲洗几次）。注意在放培养物时务必小心，不要使粪便散开。 （二）毛蚴孵化法（Miracidum Hatching Method） 毛蚴孵化法是专门用来诊断血吸虫病的，其原理是将含有血吸虫卵的粪便在适宜的温度条件下，进行孵化，等毛蚴从虫卵内孵出来后，借着蚴虫向上、向光、向清的特性，进行观察，做出诊断。方法有多种，如常规沉淀孵化法、棉析毛蚴孵化法、湿育孵化法、塑料杯顶管孵化法、尼纶筛网集卵孵化法等，这里只介绍其中两种方法。(图2-2) 1．常规沉孵法（又称沉淀孵化法或沉孵法）。 取粪便100g，放入搪瓷缸内捣碎。加水约500 ml，搅拌均匀，通过粪筛滤入另一个容器内，加水至九成满，静置沉淀，之后将上清液倒掉 ，再加清水搅匀，沉淀。如此反复3～4次。第一次沉淀时间约为30分钟左右，以后20分钟即可。最后将上述反复淘洗后的沉淀材料加30℃的温水置于三角烧杯中，瓶口用中央插有玻璃管的胶塞塞上（或用搪瓷杯加硬纸片盖上倒插试管的办法）。杯内的水量以至杯口2cm 处为宜，且使玻璃管或试管中必须有一段露出的水柱，之后放入25℃～30℃的温箱中孵化。半小时后开始观察水柱内是否有毛蚴；如没有，以后每隔1小时观察一次，共观察数次。任何一次发现毛蚴，即可停止观察。(图2-3) 毛蚴似针尖大小的白色虫体，在水面下方4cm 以内的水中作快速平行直线运动，或沿管壁绕行。可疑时，可用胶帽吸管吸出在显微镜下观察。有时混有纤毛虫，其色彩也为白色，须加以区别。小型纤毛虫呈不规则螺旋形运动或短距离摇摆；大型纤毛虫（体大、呈透明的片状）呈波浪式或翻转运动。(图2-4) 也可用锦纶筛（筛绢孔径为260目/英寸）集卵的办法来取代上述的反复水洗沉淀过程，对洗后所剩的粪渣再进行孵化。 2.棉析毛蚴孵化法（简称棉析法）。 取粪便50g，经反复淘洗或锦纶筛淘洗后（不淘洗也可），将粪渣移入300ml的平底孵化瓶中，灌注25℃的清水至瓶颈下部，在液面上方塞一薄层脱脂棉，大小以塞住瓶颈下部不浮动为宜，再缓慢加入20℃清水至瓶口1～3mm处。如棉层上面水中有粪便浮动，可将这部分水吸去再加清水。然后进行孵化。(图2-5)