试验名称：间接计数法进行总菌数测定(平板计数法).DOC

實驗名稱：間接計數法進行總菌數測定(平板計數法) 一原理: 間接計數法式將待測樣品(飲用水、廢污水、食品、乳類、空氣)等予以培養計數，常用方法為平板計數法(plate count method)，其原理是講一定體積的待測水樣經過適量的稀釋，以塗碟法或倒碟法，於平板計數培養基(plate count agar )或 (tryptone glucose extract agar)，培養24小時，在稀釋倍數已知的情況下，計算培養基上的菌落數目，便可知水中存活細菌總數。 二設備: 1.電子天秤 3. 高溫高壓滅菌釜 2.水浴鍋 4. 培養箱 三器材: 1.秤藥紙 5.培養皿 9.酒精燈 2.秤藥勺 6.試管 10.吸球 3.錐形瓶 7. 試管架 4.接踵環 8.定量玻璃吸管 四實驗步驟: (1)塗碟法(spread plate technique): 1.吸取酵母菌液1mL，置於9mL之無菌水中，充份混合後即成為10-1倍之稀釋菌液，並依前步驟製作10-2倍和10-3倍等連續稀釋菌液。 2.利用以滅菌之玻璃定量吸管過火後由五種不同稀釋系列各去0.1mL~0.2mL菌液，分別滴於五個含有NA培養皿中心處。3.將三腳彎棒置於95%酒精中從酒精中取出過火使酒精燃盡，並等待其冷卻。 4.取滅菌完之三角棒塗抹滴入之菌液，旋轉培養皿使菌液均勻分布再放入培養箱。 (2)倒碟法(pour plate): 1.吸取酵母菌液1mL，置於9mL之無菌水中，充份混合後即成為10-1倍之稀釋菌液，並依前步驟製作10-2倍和10-3倍等連續稀釋菌液。 2.製作NA培養基，製作完成後拿出泡在水浴鍋中李保持45~50度。 3.吸取25mL之NA培養基，放入試管中，滴入菌液混合倒入培養皿中。 4. 取滅菌完之三角棒塗抹滴入之菌液，旋轉培養皿使菌液均勻分布，完成滴取菌液之試驗再放至培養箱。 五實驗結果及數據: 吸光值： 稀釋倍數 吸光值 10-1 0.072 10-2 0.011 10-3 0.003 10-4 0.003 10-5 0.001 倒碟法： 稀釋倍數 菌數 10-1 無法計數 10-2 無法計數 10-3 251 10-4 28 10-5 5 塗碟法： 稀釋倍數 菌數 10-1 無法計數 10-2 無法計數 10-3 288 10-4 23 10-5 4 六問題: 1.說明10mL之菌液如何配置成10-2倍與10-3倍之稀釋菌液? 先各取1mL得原液與9mL的蒸餾水後,並加以混合成為10-1,在稀釋成10-1的菌液1mL和9mL的蒸餾水混合成為10-2,重複幾次後,再取10-2菌液加入稀釋後就會得到10-3的結果。 2. 實驗所得之總生成菌數是否真正代表樣品中微生物的數量?為什麼？ 否,因為有時會重疊成一體,以致於不是一個完整的個體狀態更無法完全準確的計算出每個菌體數,只能算大約估計。 3.為什麼進行平板計數法時,我們以0.2mL俊義進行塗抹,而不直接採1mL進行試驗? 若以1mL觀察,菌數會太龐大,或有菌種太接近重疊已形成菌落影響了計算,因此才以0.2mL的菌液下去塗抹。 4.實驗完成之TGE培養皿內的菌落數(1)30~300個之間；(2)不在30~300個之間時，其生菌數的計算方式有何不同？ (1)30~300個之間 (2)不在30~300個之間時 5.平板計數法進行計數時，其計數原則為何？ 先將稀釋過後的菌液,以塗抹法和倒碟法於平板計數於培養基 培養24小時,加上稀釋倍數在已知的情況下,在計算培養基上行成的菌落數目。 七心得: 翁銘立:這次實驗跟上次的作法大致相同,要配置培養基與10被的稀釋,檢測出來的吸光值也沒有什麼問題,隔天去觀察菌落數據也還不錯,至少這次實驗沒任何錯誤一切都非常的順利。 張瓊芳:這次間接計數跟上次直接計數的做法很像，經過兩、三次10倍稀釋跟測光值我們做的越來越有效率而且沒有任何錯誤，只是等待酵母菌跟培養皿的時間比較長。希望下次實驗可以跟這次一樣順遂！ 歐閔華:進行實驗時,需依照不同性質的培養菌種,其選擇不同的培養基,在調配過程中,也需注意,不能使雜菌混合其中,否則會產生錯誤,也必須乾淨俐落否則就算一小步驟混合一定會產生實驗結果的錯誤。 吳昱賢: 這次實驗覺得還ok,沒有什麼困難,指是要自製培養基跟等待上一組的酵母菌,時間拖得比較長而已,大致上都已經習慣10倍稀釋跟測吸光值,大家都分工合作,而隔天數菌落數也都有不錯的收穫,這次實驗滿順利的。 朱志堅: 這次的實驗