种子扩大培养及污染的检测和判别.docVIP

种子的扩大培养基污染的检测和判别 摘要 微生物工业发酵过程中，种子制备是发酵生产的第一道工序。为提高其产率及质量，要采用纯种发酵, 因此需要根据菌种的生理特性，选择合适的菌种扩大培养条件，来获得代谢旺盛、数量足够的种子。此外,纯种的制备及污染检测也是重要的一道工序。本实验主要通过种子的扩大培养及污染的检测和判别，了解种子制备的方法及影响种子质量的主要因素以及发酵染菌的危害。发酵过程中，采用了染色镜检、平板检测以及肉汤培养检测相结合的方式进行杂菌检测。染菌会对生产商造成不可估量的损失，因此，操作一定要严格控制无菌。 关键词 营养培养基???扩大培养???染色镜检???平板检测???肉汤培养检测 前言 种子制备不仅是发酵生产的第一道工序，而且是重要的工序。微生物发酵过程中，从保藏在试管中的微生物菌种，逐级扩大为生产用的种子，是一个由实验室制备到车间生产的过程，而在发酵过程中若侵入了非接种的微生物会造成杂菌污染，轻者影响产率、产物提取收得率和产品质量，重者造成“倒罐”，不但浪费大量原材料，造成严重的经济损失，还会对周围环境造成破坏[1]。因此，在发酵过程中随时检测染菌，对减少杂菌污染造成的损失至关重要。现在常用的检测方法是：细胞形态的对比、菌落形态的对比、微生物生长浊度观察、发酵参数判断。发酵污染可发生在各个时期。种子培养期染菌的危害最大，应严格防止。一旦发现种子染菌，均应灭菌后弃去，并对种子罐及其管道进行彻底灭菌[2]。 一 实验材料?? 1材料? ? 菌种：大肠杆菌?? 2仪器? ?高压蒸汽灭菌锅、超净工作台、带摇床的培养箱、显微镜 3用具 三角瓶、试管、?平板、涂布器、接种针、酒精灯 4试剂? ????葡萄糖、磷酸二氢氨、七水合硫酸镁、氯化钠、磷酸氢二钾、营养琼脂、牛肉膏、蛋白胨、0.4%酚红溶液、蒸馏水、番红?（或结晶紫） 5培养基? ⑴营养琼脂培养基（活化培养基）：直接称量营养琼脂粉?，配制200mL，pH7.2。分装试管，灭菌后摆成斜面。? ⑵种子培养基：葡萄糖0.5%、磷酸二氢氨0.1%、七水合硫酸镁0.02%、氯化钠0.5%、磷酸氢二钾0.1%? ⑶肉汤培养基：牛肉膏0.3%、蛋白胨0.8%、葡萄糖0.5%、氯化钠0.5%、0.4%?酚红溶液，pH7.2. 二 实验方法? ㈠种子的扩大培养? 1??灭菌? 将上述配置好的培养基，实验所需的玻璃仪器——培养皿、移液管，加塞三角烧瓶、试管等放于高压蒸汽灭菌锅中，在121oC条件下灭菌30min。? 2??菌种的活化? ⑴将大肠杆菌采用无菌操作的方法接种于斜面上，37oC培养18h。 ⑵培养18h后，观察菌落颜色是否一致，若均为黄色，挑取培养皿周边的菌落进行无菌检测；若颜色有黄有白，则两种颜色的菌落均要进行无菌检测。? 检测方法常用染色镜检，若检测后，没有污染，便可进行扩大培养；若检测到杂菌，要重复上述步骤，直到无菌为止，否则，不能继续下一步操作。? 3??扩大培养? 在无菌条件下，从检测后的活化培养基上选取10个菌落，用接种针接种到扩大培养基中，于37摄氏度下培养16-18h，观察菌落形态。然后配合显微镜形态观察。根据结果来判断能否进行下一步。 ㈡污染的检测和判别 1 显微镜检查? ⑴取样：用无菌操作方式取发酵液少许,涂布在载玻片上； ⑵制片、染色：自然风干后,用番红或草酸铵结晶紫染色1-2min，水洗； ⑶干燥后用显微镜下观察。 2? 平板检查? ⑴配制营养琼脂培养基，灭菌，倒平板；? ⑵取少量待检发酵液经稀释后(大约10–6～10–7)涂布在营养琼脂平板上，在37oC下培养24h；? ⑶观察菌落形态。? 3 肉汤培养法? ?将待测液接入培养基中，于37oC培养，观察培养基的状态和颜色。[3] 三 结果及讨论 结果分析 1.显微镜检查? 1.1活化菌种的镜检 镜检时，多个视野中均观察到了大肠杆菌，且观察到球菌或其他的细菌，因此可初步认为该活化菌种中感染杂菌。 1.2种子培养液的镜检 如图1所示，镜检时，多个视野中均观察到了大肠杆菌 ，且观察到大量球菌，因此可初步认为该活化菌种中感染杂菌。 2.平板检查? 如图2 从营养琼脂培养基上长出的菌落的形态上看，有不同形态的菌落。但是也不能就判定为杂菌污染，因为观察到的菌落中有几个菌落明显比其他菌落面积大，因此有可能是接种时涂布不均匀造成的。若没有不同形态的菌落，可简单说明菌液中没有污染杂菌。但可能是由于大肠杆菌为优势菌种，限制了杂菌的生长，因此杂菌的菌落较小，用肉眼看不到。为了进一步确证，可配合显微镜形态观察，若个体形态与菌落形态都与生产菌一样，则可确认没有污染杂菌；否则污染了杂菌。 此方法适合固形物多的发酵液，而且形象直观，肉眼可见，不需仪器。但需严格按照无菌操作技术，所需时间较长，而且无法区分形态与生产菌相似的杂菌。在