第8章-植物蛋白饮料中植物源性成分鉴定.docVIP

植物蛋白饮料中植物源性成分鉴定 BJS 201707 1 范围 本方法规定了食品核桃源性成分、花生源性成分、杏仁源性成分、芝麻源性成分、榛子源性成分、大豆源性成分鉴定的实时荧光PCR方法。 本方法适用于核桃露（乳）、杏仁露、果仁露等复合植物蛋白饮料中标识含有核桃源性成分、花生源性成分、杏仁源性成分、芝麻源性成分、榛子源性成分、大豆源性成分的检测及鉴定。 2 原理 提取试样中基因组DNA，以DNA为模板，利用物种特异性引物及探针进行实时荧光PCR扩增检测，同时设置阳性、阴性及空白对照。根据扩增的Ct值，判定试样中是否含有该源性成分。 3试剂和材料 除另有规定外，试剂为分析纯或生化试剂。实验用水符合GB 6682的要求。所有试剂均用无 DNA酶污染的容器分装。 3.1核桃源性成分Jugr2基因检测用引物对序列为： 核桃5’端引物:5’-CGCGCAGAGAAAGCAGAG-3’ 核桃3’端引物:5’-GACTCATGTCTCGACCTAATGCT-3’ 核桃探针：5’-FAM-TTGTGCCTCTGTTGCTCCTCTTCCC-TAMRA-3’ 3.2花生源性成分Ara b2基因检测用引物（对）序列为： 花生5’端引物:5’-GCAACAGGAGCAACAGTTCAAG-3’ 花生3’端引物:5’-CGCTGTGGTGCCCTAAGG-3’ 花生探针：5’-FAM-AGCTCAGGAACTTGCCTCAACAGTGCG-Eclipse-3’ 3.3 杏仁源性成分Prudul基因检测用引物（对）序列为： 杏仁5’端引物:5’-TTTGGTTGAAGGAGATGCTC-3’ 杏仁3’端引物:5’-TAGTTGCTGGTGCTCTTTATG-3’ 杏仁探针：5’-FAM-TCCATCAGCAGATGCCACCAAC- Eclipse-3’ 3.4芝麻源性成分2S albumim mRNA基因检测用引物（对）序列为： 芝麻5’端引物:5’-CCAGAGGGCTAGGGACCTTC-3’ 芝麻3’端引物:5’-CTCGGAATTGGCATTGCTG-3’ 芝麻探针：5’-FAM-TCGCAGGTGCAACATGCGACC- TAMRA-3’ 3.5榛子源性成分oleosin基因检测用引物（对）序列为： 榛子5’端引物:5’-CCCCGCTGTTTGTGATAT-3’ 榛子3’端引物:5’-ATGATAATAAGCGATACTGTGAT-3’ 榛子探针：5’-FAM-TCCCGTTCTCGTCCCTGCGGT- Eclipse-3’ 3.6大豆源性成分Lectin基因检测用引物（对）序列为： 大豆5’端引物:5’-GCCCTCTACTCCACCCCCA-3’ 大豆3’端引物:5’-GCCCATCTGCAAGCCTTTTT-3’ 大豆探针：5’-FAM-AGCTTCGCCGCTTCCTTCAACTTCAC- TAMRA-3’ 3.7真核生物18SrRNA内参照检测用引物（对）序列为： 内参照5’端引物: 5’-TCTGCCCTATCAACTTTCGATGGTA-3’ 内参照3’端引物: 5’-AATTTGCGCGCCTGCTGCCTTCCTT-3’ 内参照探针：5’-FAM-CCGTTTCTCAGGCTCCCTCTCCGGAATCGAAC- TAMRA-3’ 3.8 CTAB缓冲液：55 mmol/L CTAB，1400mmol/L NaCl，20 mmol/L EDTA，100 mmol/L Tris， 用10%盐酸调节pH 至8.0，121℃高压灭菌20 min, 备用。 3.9 蛋白酶K：20mg/mL。 3.10苯酚：氯仿：异戊醇（体积比：25:24:1）。 3.11 异丙醇。 3.12 70%乙醇。 3.13 Taq DNA聚合酶。 3.14 dNTP混合液。 3.15 TE缓冲液（Tris-HCl、EDTA缓冲液）：10mmol/L Tris-HCl（pH8.0），1 mmol/L EDTA（pH8.0）。 3.16 10×PCR缓冲液：200 mmol/L KCl，15 mmol/L MgCl2，200 mmol/L Tris-HCl（pH8.8）。 4仪器和设备 4.1 组织研磨器。 4.2 核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计。 4.3 恒温水浴锅。 4.4 离心机：离心力12,000g。 4.5 微量移液器（0.5μL~10μL，10μL~100μL，10μL~200μL，100μL~1000μL）。 4.6 实时荧光PCR仪。 4.7 涡旋振荡器。 4.8 天平：感量0.01g。 5分析步骤 5.1 试样总DNA的提取 固体样品：将样品粉碎后称取0.3~0.6 g，按下列方法提取DNA。也可用等效商品化DNA提取试剂盒提取DNA