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第四章、细菌基因转移和基因重组 第一节、转化 第二节、接合 第一节、转化 一、转化因子的特性及感受态 二、转化DNA的进入 三、转化DNA的整合 四、转化技术在遗传分析中的应用 一、转化因子的特性及感受态 特性: 转化因子必需是双链DNA(证明见下图) 单链DNA可使细胞转化(证明) 转化因子的大小从0.5－15 kb 单链DNA可使细胞转化的证明： 非转化因子DNA对于转化因子DNA的转化有干扰作用。如：strs DNA 对 strr DNA。 如果将两种DNA 混合在一起，加热使其变性，逐渐冷却复性，形成strs DNA 和 strr DNA杂合的双链分子，对转化不再有干扰作用。 证明：转化因子的单链可以使受体细胞转化。 感受态（Competence） 感受态是指细胞能够接受转化DNA的生理状态 感受态可以诱导产生 流感嗜血杆菌， 大肠杆菌 感受态因子 DNA结合蛋白（细胞膜） 细胞壁自溶素 单链DNA结合蛋白（ Competence-Specific ） 多种核酸酶 感受态细胞特征 细胞表明正电荷增加 细胞壁通透性加大 细胞表面分解DNA的能力加强 这些特征均由感受态因子引起，使细胞有利于吸收外源DNA。 二、转化DNA的进入 革兰氏阳性菌转化（图9－14） 1）细胞分泌感受态因子，出现感受态， 2）双链DNA吸附细胞表面特异受体， 3）双链DNA被内切酶切成4－5MD的片段，外切酶将一条链降解。 4）另一条链与感受态蛋白接合进入细胞。 革兰氏阴性菌转化 （图4－2） 1）感受态细胞表面形成转化小体（transformasome） 2）转化双链DNA被吸收进转化小体， 3）一条链降解，另一条链被转化小体送入细胞质。 三、转化DNA的整合 转化的隐晦期 转化因子被吸收进受体细胞后失去转化活性，这段时间称为转化的隐晦期 整合分为2个过程： 1、转化因子 ssDNA与受体染色体DNA的同源部分 形成供体－受体复合物。 2、供体DNA 与受体DNA 形成共价键。 转化效率的高低决定于3个因素： 受体细胞的感受态，决定转化因子能否进入细胞。 受体细胞的限制酶，决定转化因子在整合前是否被降解。 供体与受体DNA的同源性，决定转化因子能否被整合。  四、转化技术在遗传分析中的应用 可通过共转化分析连锁的基因 共转化（Cotransformation）: 2个连锁的基因同时被转化。 判断连锁的标准：观察转化DNA浓度下降时，转化频率的改变。 若a,b连锁，DNA浓度下降时，a,b 共转化＝a,b单独转化； 若a,b不连锁，DNA浓度下降时，a,b 共转化的下降幅度远远大于a,b单独转化。（见图4－3） 利用 cotransformation frequencies 判断基因连锁及计算图距的实例：枯草芽孢杆菌转化实验（见下表） 枯草芽孢杆菌中 trp2, his2 及 tyr1 三基因的排列顺序及其图距: trp2 his2 tyr1 34 13 第二节、接合作用 一、细菌接合的发现与证实 二、细菌接合的遗传学分析 1 单向转移现象与性因子F 2 高频重组品系Hfr 3 F + X F- ,Hfr X F- 4 F’ 转导 质粒从供体细胞转移至受体细胞的过程称为接合作用（Conjugation）。 特点： 1 供体与受体需直接接触。革兰氏阴性菌通过性菌毛，革兰氏阳性菌通过分泌类似性激素的短肽而刺激细胞接合。 2 可转移质粒的大小在不同的细菌中差别较大。 3 质粒不但可以自身转移，还能带动供体染色体转移。 一、细菌接合的发现与证实 1、发现 Yalu University :Lederberg(1925 - ) Tatum(1909 - 1975) 实验材料： E.Coli k12 58-161 met – bio – the + leu + E.Coli k12 w677 met + bio + the – leu – 一、细菌接合的发现与证实 2、基因重组的证实—非选择性标记基因的分 离分析 选择性标记：指实验设计时加以考虑的、使重组体子代成活的标记基因，即被用来选择重组子的基因。 选择性培养基：