Chelex-100法提取真核表达质粒pcDNA3-HERG应用体会.doc

Chelex-100法提取真核表达质粒pcDNA3-HERG应用体会作者单位：450003 河南省人民医院? 通讯作者：杨海涛 【摘要】 目的 探讨Chelex-100法提取先天性长QT综合征相关人类真核表达质粒pcDNA3-HERG的可行性。方法 分别用Chelex-100法和碱裂解法提取pcDNA3-HERG质粒，将环状质性DNA酶切为线性，0.8%琼脂糖凝胶电泳后紫外灯下检测质粒提取的有效性。结果 用Chelex-100法和碱裂解法提取的pcDNA3-HERG质粒的OD（A260/A280）比较差异无统计学意义［分别为（1.8±0.6），（1.9±0.4），?P?0.05］，经0.8%琼脂糖凝胶电泳后紫外灯下检测均有特定的清晰条带。结论 两种方法均能提取纯度较高的大肠杆菌质粒DNA，Chelex-100法简便、省时，值得推广。? 【关键词】 pcDNA3-HERG； 真核表达质粒质粒； Chelex-100 法； SDS-碱裂解法? doi:10.3969/j.issn.1674-4985.2012.06.093 ?? 先天性长QT综合征（long QT syndrome，LQTS）是由于编码心肌离子通道蛋白的基因突变导致心肌细胞膜离子通道功能障碍而引起的一组临床综合征。目前已发现了10个LQTS的相关基因，其中HERG基因突变引起编码心脏延迟整流钾电流功能障碍的长QT综合征在中国较为常见。人类真核表达质粒pcDNA3-HERG是研究该蛋白功能的有效工具。经典的碱裂解法是一种应用最为广泛的制备质粒DNA的方法，适合于所有生物检材，且提取的质粒纯度高，但操作繁琐、复杂、费时，本文旨在探讨一种新的操作步骤简单、省时提取质粒的方法，现报告如下。? 1 资料与方法 1.1 大肠杆菌质粒来源 大肠杆菌感受态细胞DH5a：北京天为时代生物公司。 1.2 主要试剂 质粒pcDNA3-HERG：美国Wisconsin大学Anson BD博士惠赠，Chelex-100（Bio-Rad），DL2000marker（北京天为时代生物公司），碱裂解法质粒小量制备试剂盒DP2602（北京百泰克），固体培养基，限制性内切酶BamHI（购自Promega公司），50×TAE，溴化乙锭（EB），0.8%琼脂糖凝胶，其余试剂均为进口及国产。 1.3 主要设备 小型DNA电泳仪及电泳槽（日本产）、低温离心机（Backman）、电磁炉（上海产），WP型紫外透射反射分析仪（上海医疗器械厂）、可见分光光度机（日本岛津，UV-2401PC型）、全自动凝胶成像及分析系统（法国VL）、电热恒温水浴箱（上海医疗器械厂）。 1.4 大肠杆菌的培养 挑取LB固体培养基上生长的单菌落，接种于2.0 ml LB（含氨苄青霉素）液体培养基中，37 ℃、250 g振荡培养过夜（约12~14 h）。 1.5 SDS-碱裂解法提取质粒pcDNA3-HERG 于1.5 ml Ep管中加入1.5 ml大肠杆菌液，按照碱裂解法质粒小量制备试剂盒DP2602说明书进行操作，最终用70 μl EB洗脱缓冲液将大肠杆菌质粒DNA洗脱保存。 1.6 Chelex-100提取质粒pcDNA3-HERG 于1.5 ml Ep管中加入1.5 ml大肠杆菌液轻轻振荡5 min，以求充分混匀，?12 000 r/min?离心2 min，去上清液，加200 μl 5% Chelex-100，56 ℃保温30 min，剧烈振荡5 s，沸水煮8 min，1000 r/min离心3 min，上清液即含用于酶切的质粒DNA样品。 1.7 质粒DNA定量 在微量紫外分光光度计上分别测两种不同方法提取质粒DNA的吸光度（A，曾称光密度OD）值。 1.8 琼脂糖凝胶电泳鉴定 将获得的环状质粒用BamHI酶切为线性，反应体系如表１，快速混匀后，置37 ℃水浴1.5 h后，酶切产物经0.8%含溴化乙锭的琼脂糖凝胶电泳鉴定。 表1 酶切反应体系（μl）? 试剂体积 pcDNA310 BSA2 Buffer（10×）5 灭菌去离子水12 BamHI1 1.9 统计学处理 计量资料以均数±标准差（?x±s?）表示，采用两样本均数?t?检验法进行统计学处理，?P?0.05）。 2.2 用两种方法提取的质粒DNA片段均为9.3 kp，且条带清晰可见（图1）。 注：1为Chelex-100 法提取的质粒，2为SDS-碱裂解法提取的质粒 3 讨论? 质粒pcDNA3-HERG和细胞内DNA不同的是质粒呈环状，作为表达载体有其特有cDNA启动子等其表达所需要的上游调节片断。但其实质仍然