Ras相关核蛋白及缺氧诱导因子HIF-1α在胃癌组织中表达及临床意义.doc

Ras相关核蛋白及缺氧诱导因子HIF-1α在胃癌组织中表达及临床意义[摘要] 目的 探讨Ras相关核蛋白（Ran）和缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）在胃癌浸润、转移过程中的机制及其相互作用。 方法 采用免疫组化PV-9000二步法检测70例胃癌组织和70例癌旁正常胃组织（距癌灶5 cm以上）中Ran和HIF-1α的表达。 结果 胃癌组织中Ran表达水平显著高于癌旁正常组织（P 1 资料与方法 1.1 一般资料 收集湘潭市中心医院2009年5月~2011年5月手术切除的胃癌标本及其配对的距癌灶5 cm以上的癌旁组织标本各70例，标本均经组织病理确诊，患者术前均未接受放化疗。其中，男40例，女30例，年龄35~76岁，中位年龄58岁，胃癌患者临床分期按2003年国际抗癌联盟（UICC）颁布的胃癌TNM分期标准：Ⅰ期7例，Ⅱ期21例，Ⅲ期33例，Ⅳ期9例；胃癌分化程度：低分化腺癌26例，中分化腺癌29例，高分化腺癌15例；胃癌浸润深度：浸润黏膜层及黏膜下层（T1）5例，浸润固有肌层（T2）19例，浸润浆膜层（T3）34例，浸润邻近器官或组织（T4）12例；淋巴结转移：无转移27例，有转移43例。 1.2 主要试剂 鼠抗人HIF-1α单克隆抗体、兔抗人Ran多克隆抗体及其他相关试剂均购自北京中杉金桥生物技术有限公司。 1.3 检测方法 每个石蜡标本4 μm厚度连续切片，摊片后，切片放置于60℃温箱烘烤2 h预处理。采用免疫组织化学染色PV9000二步法，具体步骤如下：切片60℃预热30 min。石蜡切片常规脱蜡水化（二甲苯脱蜡10 min×2，梯度酒精水化95% 3 min ×3，80% 3 min，70% 3 min，蒸馏水5 min×2）。煮沸修复：取一定量枸橼酸盐缓冲液（pH =6.0）于不锈钢压力锅中加热至沸腾，切片置于金属架上，放入锅内，使切片位于液面以下，盖锅压阀。当压力锅开始慢慢喷气时（约加热6 min），计时2 min，然后将压力锅端离热源，冷水冲至室温后，取下气阀，打开锅盖，取出切片，先用蒸馏水冲洗3 min×3，然后用PBS（pH =7.2~7.4）冲洗3 min×2。3%过氧化氢室温下孵育10 min，阻断内源性过氧化物酶的活性，PBS冲洗3 min×3。除去PBS液，滴加一抗，室温下孵育1 h，PBS冲洗3 min×3。除去PBS液，滴加聚合物辅助剂，室温下孵育20 min，PBS冲洗3 min×3。除去PBS液，滴加辣根酶标记羊抗兔IgG多聚体，室温孵育30 min，PBS冲洗3 min ×3。除去PBS液，滴加新鲜配制的DAB底物显色液，显微镜下观察3~5 min，至出现阳性结果而又无明显背景着色，中止反应，自来水冲洗。苏木素复染，1%盐酸分化，氨水反蓝，自来水冲洗，切片经梯度酒精脱水干燥，二甲苯透明，中性树胶封片。以PBS代替一抗，步骤同上，作阴性对照。 1.4 免疫组化结果判定 以细胞胞浆或胞膜出现黄色颗粒为阳性，根据细胞染色强度及染色细胞所占百分比计分，以计分之和来判断结果，按染色强度评分：无色为0分，淡黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分；按阳性细胞所占百分比评分：阴性为0分，阳性细胞数＜10%为1分，10%~24%为2分，25%~49%为3分，≥50%为4分。按计分之和分为4个等级：-（0）；+（1，2）；++（3，4）；+++（5，6），计分之和2分为高表达，≤2为低表达。 1.5 统计学方法 应用SPSS 17.0统计学软件处理实验数据，计数资料组间比较采用χ2检验，等级相关资料采用Spearman等级相关检验，以P 0.05）。见表3。 2.2.2 HIF-1α在胃癌组织中的表达与临床病理特征间的关系 HIF-1α在T1、T2、T3、T4的阳性表达率分别为40.00%（2/5）、63.16%（12/19）、85.29%（29/34）及91.67%（11/12）；Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期、Ⅳ期的阳性表达率分别为42.86%（3/7）、66.67%（14/21）、84.85%（28/33）及100.00%（9/9）；淋巴结转移组的阳性表达率为88.37%（38/43），无淋巴结转移组的阳性表达率为59.26%（16/27），差异均有统计学意义（均P 0.05）。见表4。 2.3 Ran和HIF-1α在胃癌组织中相关性 Ran和HIF-1α在胃癌中的表达，经Spearman等级相关统计学处理（r = 0.363，P 关于Ran和HIF-1α两者之间的研究甚少，经相关性分析发现，两者具有正相关性，这提示Ran与HIF-1α存在着调控关系，HIF-1α/Ran通路在调节肿瘤细胞