乌司他丁对胃癌细胞c-met基因表达及增殖影响探究.doc

乌司他丁对胃癌细胞c-met基因表达及增殖影响探究[摘要] 目的：观察乌司他丁对胃癌细胞c-met基因表达及增殖的影响，为乌司他丁用于胃癌的治疗提供理论依据。方法：取对数生长期人胃癌BGC-823细胞，随机分为空白组、对照组和乌司他丁组。空白组加入RPMI 1640培养液3 ml，对照组培养液中加入奥沙利铂(L-OHP)至终浓度为1 mmol/L(对照1组)和0.5 mmol/L(对照2组)，乌司他丁组培养液中加入乌司他丁至终浓度为320 U/ml(乌司他丁1组)和160 U/ml(乌司他丁2组)，分别置于培养箱中培养48 h。采用RT-PCR检测胃癌细胞c-met mRNA的表达情况；ELISA检测细胞抑制率；活细胞计数计算细胞倍增时间，以评估乌司他丁对胃癌BGC-823细胞增殖的抑制情况。结果：乌司他丁组与空白组及对照组比较，c-met mRNA的表达均有显著性差异(P 1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 细胞人胃癌细胞株BGC-823细胞由中科院上海细胞生物所细胞库提供。 1.1.2 主要试剂奥沙利铂(L-OHP，江苏恒瑞医药股份有限公司)，乌司他丁(广东天普生化医药股份有限公司)，RPMI 1640(美国GIBCO公司)，小牛血清(浙江省杭州四季青生物工程材料有限公司)，抗c-met基因蛋白抗体为鼠抗人单克隆抗体(S-19)，酶联免疫吸附试剂盒(Santa Cruz公司)；1:125胰蛋白酶(美国GIBCO公司)，RNArose Reagent(上海华舜生物工程有限公司)；Takara RNA PCR Kit (AMV) Ver. 3.0[宝生物工程(大连)有限公司]，ANGPTL3引物和β-actin引物(上海生物工程技术服务有限公司)。 1.1.3 主要仪器酶联免疫检测仪(美国EL340型)。 1.2 方法 1.2.1 人胃癌细胞培养BGC-823细胞在含10%小牛血清的RPMI 1640培养液、37℃、5%CO2的培养箱中培养。取对数生长期细胞，用0.25%胰蛋白酶消化，用4 g/L台盼蓝染色后计算细胞存活率，并进行活细胞计数，调整细胞悬液密度为5×104/ml备用。 1.2.2 c-met mRNA表达检测将备用的细胞悬液接种于6孔板中，500 μl/孔，分为空白组、对照组（1 mmol/L、0.5 mmol/L）和乌司他丁组(320 U/ml、160 U/ml)，每组设4个复孔。4 h细胞完全贴壁后加入受试药物，空白组加入RPMI 1640培养液3 ml，对照组培养液中加入L-OHP至终浓度为1 mmol/L(1组)和0.5 mmol/L(2组)，乌司他丁组培养液中加入乌司他丁至终浓度为320 U/ml(1组)和160 U/ml(2组)，分别置于培养箱中培养48 h。按RNArose Reagent使用说明提取细胞总RNA，采用RT-PCR方法[Takara RNA PCR Kit (AMV) Ver. 3.0]检测c-met mRNA表达情况。 c-met引物设计： 正义链 5’-TCTTCTTCCTCGGACTCGCT-3’； 反义链 5’-GGTGTCGTTTGGAGGTGTGT-3’； 引物长度228 bp。 β-actin引物设计： 正义链 5’-ACCCCCACTGAAAAAGATGA-3’； 反义链 5’-ATCTTCAAACCTCCATGATG-3’； 引物长度120 bp。 1.5%琼脂糖凝胶电泳图像采集分析，c-met与β-actin条带灰度比值作为c-met mRNA的表达参数。 1.2.3 人胃癌BGC-823细胞增殖情况监测[3]将备用的细胞悬液接种于96孔板中，90 μl/孔，每组设4个复孔。4 h细胞完全贴壁后加入受试药物，10 μl/孔。置于培养箱中分别培养48 h用于检测细胞抑制率。实验终止前4 h，每孔加入MTT(5 mg/ml)10 μl，实验结束后加入三联液(10% SDS-5%异丁醇-0.012 mol/L盐酸) 100 μl/孔，置于培养箱中培养12 h后，用EL340酶联免疫仪在570、630 nm双波长下测定每孔的OD值，计算细胞抑制率。 细胞抑制率(%)=1-( )×100%。 另将备用的细胞悬液接种于6孔板中，2 ml/孔，每组设3个复孔。4 h细胞完全贴壁后加入受试药物，待细胞基本长满后，消化，用台盼蓝染色后行活细胞计数，计算细胞倍增时间(TD)，TD =Tlg2/lg(Nt/N0) (T：细胞培养时间；Nt：细胞经过T时间培养后的细胞总数；N0：初始时的细胞总数)。 1.3 统计学方法 应用SPSS 1