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甘草甜素抗肝星状细胞增殖相关机制探究【摘要】目的:探讨甘草甜素抑制肝星状细胞增殖的相关机制。方法:用MTT法检测三组不同浓度甘草甜素对肝星状细胞增殖的抑制率,用免疫细胞化学法检测细胞周期素cyclinD1以及PCNA的表达情况。结果 MTT法检测不同药物浓度组:空白对照组、0.8mg/L 甘草甜素组、1.2mg/L甘草甜素组、1.6mg/L甘草甜素组细胞增殖抑制率分别为0,2.73%,14.75%,25.96%,有统计学意义(F=19.364,P 1.2.4 免疫细胞化学法(SABC法)检测PCNA、cyclinD1的表达:取对数生长期细胞,经上述相同处理后接种于置有经多聚赖氨酸处理的盖玻片的24孔板中,置于37℃,5%CO2孵箱中培养,待细胞生长达70%融合,将细胞分为4组: 空白对照组、0.8mg/L 甘草甜素组、1.2mg/L 甘草甜素组、1.6mg/L 甘草甜素组。以无血清培养基洗细胞三次,加入不同浓度甘草甜素。 甘草甜素处理24h后,4%多聚甲醛固定细胞15min, 0.3% Tri-tonX-100通透细胞30min,3%过氧化氢-甲醇液中浸泡10min,非免疫性动物血清中孵10min,加一抗(PCNA、cyclinD1单克隆抗体)4℃冰箱过夜后,生物素标记的二抗中孵育10min,加HRP标记链亲和素孵育10min(以上每次操作均用PBS洗细胞3次后再进行下一步)。然后进行DAB显色(显微镜下观察掌握显色程度):自来水充分冲洗,苏木素复染,盐酸酒精分化,梯度酒精脱水,二甲苯透明,中性树胶封片,显微镜下观察,照相。 以PBS代替一抗作阴性对照。每组细胞各进行6次独立性实验。PCNA、cyclinD1阳性结果判断:PCNA染色:细胞核着色,染成棕黄(褐)色为阳性,浅(灰)蓝色视为阴性;cyclinD1定位于胞核,胞核染色棕黄色为阳性(cyclinD1在胞核可见棕褐色颗粒)[2],浅(灰)蓝色视为阴性。400倍镜下,PCNA、cyclinD1指数通过随机选择5个高倍视野,每视野计数100个细胞中的阳性细胞数。取平均数作为计数指标。 1.2.5 统计学分析:结果用X±s表示,数据统计分析利用SPSS 14.0软件完成,比较采用单因素方差分析,以P 综上可见,甘草甜素通过降低大鼠肝星状细胞cyclinD?1、PCNA表达,发挥抑制大鼠肝星状细胞增殖的作用,具体机理可能是甘草甜素阻滞钙离子通道,降低细胞内钙离子浓度,抑制钙离子信号途径,减少cyclinD?1蛋白表达进而降低PCNA蛋白表达,后者则阻止细胞通过G?1-S调控点进入S期,使其停滞于 G?0/G?1期,细胞无法进入自主分裂程序,细胞增殖受到抑制。可见,甘草甜素能够浓度依赖性的抑制大鼠肝星状细胞增殖。可通过降低细胞周期素cyclinD?1及PCNA的表达而抑制大鼠肝星状细胞的增殖。 参考文献 [1] 王志凌 成军 刘妍等,甘草甜素抑制肝星状细胞增殖作用的研究[J].肝脏2005年9月第10卷第3期 [2] Hammel P,Couvelard A,O’Toole MD,et a1. Regression of liver fibrosis after billary drainage in pents with chronic pancreatitis and stenosis of the common bile duct[J].N Earl J Med,2001,344:18 [3] Gabele E,Brenner DA,Rippe RA.Liver fibrosis:signals leading to the amplificationof the fibrogenic hepatic stellate cell[J].Front Biosci,2003,8:69~77 [4] Lamireau T,Desmouliere A,Bioulac Sage P,et al.Mechanisms of hepatic fibrogensis[J].Arch Pediatr.2002,9(4):392~405 [5] 王俊韬,于少军,肖炜.复方甘草甜素(美能)在肝病领域的临床应.中国药房,2002,13(8):50 [6] 贾道奎,张正,罗成福等,甘草甜素逆转肝纤维化及早期肝硬化的作用探讨[J]。中华消化杂志2001年l2月第2l卷第l2期Chin J Dig,December 200l,V021,No12 [7] 王吉耀,刘维田,胡美亚,等 甘草酸对成纤维细胞1,3型前胶原mRNA表达的抑制作用.中华消化杂志,1997,2:60~61 [8] Ono M,Miy