耐亚胺培南铜绿假单胞菌临床分离及耐药机制分析.docVIP

耐亚胺培南铜绿假单胞菌临床分离及耐药机制分析[摘要] 目的：了解我院耐亚胺培南铜绿假单胞菌（IRPA）的临床分布情况，并探讨其耐药机制。方法：对2009年1月～2010年12月我院住院患者临床分离的非重复性IRPA的数据资料进行统计分析，采用PCR方法检测金属酶基因和外膜通道蛋白基因。结果：从404株铜绿假单胞菌中共分离出100株IRPA，分离率为24.75%。其中90株（90.0%）IRPA来源于下呼吸道痰液标本；IRPA主要来源于重症医学科（ICU）；IRPA对阿米卡星最敏感率为73.0%（耐药率为27.0%），其次是哌拉西林/他唑巴坦（敏感率为63.0%），哌拉西林（敏感率为59.0%），庆大霉素（敏感率为58.0%），头孢他啶（敏感率为57.0%），其余药物的敏感率均 表1 耐药基因PCR 引物序列 1.2 方法 1.2.1 细菌培养及分离 临床送检的各类标本严格按照《全国临床检验操作规程》进行细菌的分离培养。分纯后的铜绿假单胞菌用小牛血清保存至-80℃冰箱待用。 1.2.2 菌株鉴定及药敏试验方法 所有菌株均以BD Phoenix100全自动微生物分析仪鉴定到种，必要时采用梅里埃ATB-Expression半自动细菌分析仪补充鉴定。药敏试验采用BD Phoenix 100革兰阴性细菌配套药敏试验复合板，包括阿米卡星、阿莫西林/克拉维斯、氨苄西林、氨苄西林/舒巴坦、氨曲南、头孢唑啉、头孢吡肟、头孢噻肟、头孢他啶、氯霉素、环丙沙星、庆大霉素、亚胺培南、美洛培南、左氧氟沙星、哌拉西林、哌拉西林/他唑巴坦、四环素、复方磺胺、多粘菌素E，共20种抗菌药物。 1.2.3 基因扩增 采用煮沸法提取模板DNA，oprD2基因扩增条件为：95℃预变性3 min, 然后95℃ 30 s→55℃ 30 s→72℃ 60 s，循环35个周期，最后72℃延长5 min；其余基因扩增条件为：95℃预变性3 min，然后95℃ 60 s→55℃ 60 s→72℃ 60 s，循环35个周期，最后72℃延长5 min。取PCR产物4 μg经1%琼脂糖凝胶电泳，EB染色后在凝胶成像系统中观察结果。 1.2.4 PCR产物测序 使用DNA凝胶回收纯化试剂盒（购自TaKaRa）将PCR产物割胶纯化，送至深圳华大基因测序，序列登录GenBank进行比对分析。 2 结果 2.1 IRPA的分离率 从404株铜绿假单胞菌中检出IRPA 100株，分离率为24.75%。其中大多数分离自痰液标本90株，占90.0%，其次为血液和脓液标本，均为3株，各占3.0%，分离自伤口分泌物和胆汁标本均为2株，各占2.0%。 2.2 IRPA感染者科室分布 IRPA感染者主要来自重症医学科，占31.0%，其次为呼吸内科和神经内科，分别为20.0%和16.0%，具体科室分布情况见表2。 2.3 IRPA对抗菌药物的耐药性 100株亚胺培南耐药的铜绿假单胞菌，对阿米卡星的耐药率最低，为27.0%，耐药率在30.0%～50.0%的有4种抗菌药物：头孢他啶、庆大霉素、哌拉西林、哌拉西林/他唑巴坦；耐药率在50.0%～70.0%的有4种抗菌药物：氨曲南、环丙沙星、左氧氟沙星、头孢吡肟；对其余10种抗菌药物的耐药率均70.0%，其中，氨苄西林、氨苄西林/舒巴坦、头孢唑啉和氯霉素的耐药率为100%。具体耐药情况见表3。 表3 耐亚胺培南铜绿假单胞菌的耐药情况 2.4 MBL基因及oprD2基因检测结果 100株IRPA中，检测到IMP基因阳性1株（PA47），阳性率为1.0%，oprD2基因缺失65株（PA47为扩增阳性菌株），阳性率为65.0%，其余耐药基因（VIM、GIM、SPM）均未检出。 2.5 IMP基因测序结果 通过对PA47菌株的IMP基因PCR产物进行正向测序，经Clustal W程序分析，其核酸序列与GenBank已登陆的blaIMP-9序列（登录号：AY033653）的同源性为100%，可判定为IMP-9型基因。PA47_blaIMP在GenBank的登录号为JN107561。 3 讨论 近年来，由于化疗、放疗、免疫抑制剂及各类侵入性诊疗项目在临床的广泛开展，非发酵类病原菌引起的医院感染逐渐增多，其中铜绿假单胞菌分离量占首位（45.4%）[2]。碳青霉烯类抗生素（亚胺培南、美罗培南等） 具有抗菌谱广、抗菌活性强、对β-内酰胺酶稳定性高等优点，已成为治疗IRPA感染最有效的抗生素[3]。然而，随着该类抗生素在临床治疗中的广泛应用，铜绿假单胞菌对它的耐药率也呈不断上升的趋势，中国CHINET细菌耐药性监测报道，1994~2001