糖酵解中间产物鉴定.docVIP

二．教案与讲稿 一、教案 课程名称 生物化学实验 授课专业和班级 2005级临床本科及麻醉本科 授课内容 糖酵解中间产物的鉴定 授课学时 4学时 授课地点 分析实验室 日期 2006.11.13 节次 6、7、8、9节 教学目的 对糖酵解过程进一步加深理解；初步了解一碘醋酸对酶的抑制作用；通过一碘醋酸和硫酸肼的作用，了解使中间产物堆积的方法对研究中间代谢的意义。 教学重点 了解一碘醋酸对酶的抑制作用；通过一碘醋酸和硫酸肼的作用，了解使中间产物堆积的方法在研究中间代谢中的意义。 教学难点 通过一碘醋酸和硫酸肼的作用，了解使中间产物堆积的方法在研究中间代谢中的意义。 教具 黑板、粉笔、实验材料、实验仪器等。 教学方法 小班讲课 教学过程 再次强调实验室规则要求，对上次的实验进行评价和总结 10分钟 简述实验过程，并对实验所用的实验仪器作介绍 5分钟 阐述实验原理 35分钟 糖酵解中间产物的鉴定的具体操作（学生） 100分钟 实验结果观察与讨论 10分钟 参考书籍 （1）张文峰，黄林邦主编《分析与检测实验技术》（江西高校出版社） （2）周爱儒主编《生物化学》（第六版，人民卫生出版社） 思考题或/及作业 （1）影响本次实验的因素？ （2）怎样才能克服影响实验结果的因素？ 课后总结 二、讲稿 [实验目的] 1.通过本实验对糖酵解过程进一步加深理解。 2.初步了解一碘醋酸对酶的抑制作用。 3.通过一碘醋酸和硫酸肼的作用，了解使中间产物堆积的方法在研究中间代谢的意义。 [实验原理] [实验步骤] 肝匀浆的制备 取兔肝3g剪碎，在研钵中先加Krebs-Ringer缓冲液2ml，待研匀后再加5ml缓冲液。 取试管3支，按下表操作： 管号 1管 2管 3管 Krebs-Ringer缓冲液 （ml） 2 2 2 0.002M 10 10 - 0.56M硫酸肼（d） 10 10 - 10％三氯醋酸（d） 25 - - 肝匀浆（ml） 1 1 1 摇匀，37度水浴50分钟 0.002M一碘醋酸（d） - - 10 0.56M硫酸肼（d） - - 10 10％三氯醋酸（d） - 25 25 摇匀，静置5分钟，分别过滤 1’ 2’ 3’ 滤液（ml） 1 1 1 0.75NNaOH（ml） 0.5 0.5 0.5 摇匀，静置10分钟 2、4-二硝基苯肼（d） 10 10 10 摇匀，37度水浴5分钟 0.75NNaOH（ml） 3.5 3.5 3.5 观察各管现象。 [实验结果] 管号 1’ 2’ 3’ 现象 浅棕色或淡黄色 棕红色 淡黄色 [讨论] 第1管中，水浴之前已加有三氯醋酸，可使参与糖酵解酶变性。但三氯醋酸与肝匀浆比例不当，不能使所有的酶变性，糖酵解过程中各种酶有少量活性，故必然有各种中间代谢物的生成，其中包括磷酸二羟丙酮与3-磷酸甘油醛。由于加有一碘醋酸与硫酸肼，故这二种中间代谢物堆积。故本管中有成腙反应，参与成腙反应的磷酸丙糖少量堆积。 第2管中，水浴之前未加有三氯醋酸，各种酶处在适宜条件下。但水浴之前加有一碘醋酸与硫酸肼，故糖原及磷酸丙糖之前步骤的中间代谢物将在实验过程中进行不完全的糖酵解，使磷酸丙糖堆积。故本管中有成腙反应，参与成腙反应的磷酸丙糖堆积。 第3管中，水浴之前未加有三氯醋酸、一碘醋酸、硫酸肼，各种酶处在适宜条件下，糖原及各中间代谢物均在实验过程中发生彻底的糖酵解，转变成终产物。故本管无成腙反应。 [结论] 3-磷酸甘油醛与磷酸二羟丙酮是糖酵解的中间产物。 [注意事项] 操作中应严格按表加样，避免溶液的错加、多加、漏加。 用吸量管及吸管加样多种不同液体时，应在每次加样另一种液体之前用清水洗净。 每次水浴前必须摇匀。 过滤的方法。