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实验2 淀粉酶活力的测定 【摘要】本次试验目的在于通过实际的操作与观察，掌握酶活力测定的方法以及巩固分光光度计的使用。根据淀粉酶催化淀粉水解产生的葡萄糖、麦芽糖等还原糖能够与3,5-二硝基水杨酸作用，生成棕红色的3-氨基-5-硝基水杨酸，通过分光光度计测定棕红色溶液的吸光度值，并与标准葡萄糖-吸光度值曲线进行对比，即可知道实验中生成的还原糖的量，从而测定酶活。比对试验结果，发现本组的实验数据与别组的存在一定差别，本次实验所得结果欠佳。 【材料与设备】如表1所示 表1 淀粉酶活力测定实验材料设备一览表 试剂 仪器 玻璃器皿 稀释200倍的淀粉酶原液 风光光度计 试管（16根 葡萄糖溶液 恒温水浴锅 移液枪，枪头 洗脱峰1.2.3 电磁炉 移液管 3,5-二硝基水杨酸 试管架 1%淀粉溶液 【实验步骤】 1. 葡萄糖标准曲线的测定 （1）取7支试管，按如下表2所示，加入试剂 　　　　　　　　　表2 葡萄糖标准曲线加样表 试剂 管号 1 2 3 4 5 6 7 葡萄糖标准液（ml） 0 0.1 0.3 0.5 0.7 0.9 1.0 蒸馏水（ml） 1.0 0.9 0.7 0.5 0.3 0.1 0 3,5-二硝基水杨酸（ml） 1.0 (2)将各管摇匀，置于沸水浴 (3)取出试管，冷却近室温，加入8ml蒸馏水 （4）以1号管为对照，测定各管在540nm下的吸光度，并记录 2.酶活力的测定 （1）四组样品（稀释200倍的酶原液、洗脱峰1、洗脱峰2、洗脱峰3）分别按照如下表3操作进行，即每个样品测两管，对照组缓冲液只需测定一管 表3 酶活力测定加样一览表 操作项目 编号 1-1 1-2 缓冲液 添加酶液（ml） 0.1 0.1 0.1 3,5-二硝基水杨酸（ml） 0 0 1.0 1%淀粉溶液(ml) 0.9 0.9 0.9 酶解反应 40℃,10min 100℃,5min 3,5-二硝基水杨酸（ml） 1.0 1.0 0 沸水浴 5min 定容 加入8ml蒸馏水 （2）将各管摇匀后，于540nm下测定吸光度值，并记录 【实验结果】 原始数据记录 (1)葡萄糖标准曲线的测定：原始数据记录如表4所示 表4 测定葡萄糖标准液吸光度原始数据记录表 试管号 1 2 3 4 5 6 7 葡萄糖含量(ml) 0 0.1 0.3 0.5 0.7 0.9 1.0 A540 0 0.155 0.169 0.278 0.366 0.521 0.596 （2）酶活力测定：原始数据记录如表5所示 表5 酶活力测定原始数据记录表 样品 稀释200原酶液 洗脱峰1 洗脱峰2 洗脱峰3 缓冲液 试管编号 原-1 原-2 1-1 1-2 2-1 2-2 3-1 3-2 1 吸光度值A540 1.213 1.130 0.319 0.397 0.811 0.809 0.398 0.369 0.278 数据处理 葡萄糖标准曲线的绘制 所以，葡萄糖标准曲线方程为y=0.0968x+0.0291 （1） 酶活力的测定 以洗脱峰2的一组数据为计算示例： 平均吸光度A1=(0.811+0.809)/2=0.8065 纯吸光度A2=0.8065-0.278=0.5285 带入式子（1） 即0.5285=0.0968x+0.0291 解得 x=5.16umol 所以实验中0.1mol洗脱峰生成还原糖的物质的量为n=5.16umol 本实验中规定每min生成1umol的还原糖为1U 所以0.1ml洗脱峰2的酶活为5.16/10=0.516U 1ml洗脱峰2的酶活力为0.516*10=5.161U/ml 其余计算结果汇于下列表6中 表6 酶活力测定实验结果记录表 样品 稀释200原酶液 洗脱峰1 洗脱峰2 洗脱峰3 酶活力（U） 8.93 0.53 5.16 0.79 【讨论】 经过本次实验，基本掌握了酶活力测定的一种方法，也更加熟练的对分管光度计进行了操作。实验当中，有一些需要注意的地方：首先，要严格控制实验的酶解反应时间以及温度，因为温度和反应时间是影响酶活性的关键因素此外，由于加入的底物淀粉中本身也含有葡萄糖，所以实验需要设置对照组，来扣除底物中葡萄糖对实验结果的影响。 在与别的组对比的过程中发现，本次实验结果数据波动很大，缓冲液所测得的数据结果偏小，可能原因是5min煮沸的时候未控制在沸点，变成5min加热至沸的情况，造成反应不彻底。洗脱峰1和洗脱峰3的数值与别组相比，偏小比较多，可能原因是加热过程发生问题，也可能是试剂在添加的过程中出现了管内气泡，造成实际加入的试剂量减少，从而引起误差。