质粒pcr产物.pptVIP

扩增子二级结构 Bad location for primers /mfold/applications Good location for primers 引物位置 1 110 Forward Primer Reverse Primer A Primer B Reverse Primer B Primer B: h = 95.8 % Primer A: h = 66.3 % Primer A 实验流程 Aurum Total RNA kit iScript cDNA Synthesis Kit RNA提取 qPCR实验 数据处理 RNA定量 反转录(RT) qPCR实验设计 DNA提取 qPCR预实验 利用SYBR Green I 进行定量试验检测下列指标 扩增效率 重复性 特异性（结合融解曲线分析） 利用琼脂糖凝胶电泳检测下列指标 特异性 如何检验实验的设计是否合适 认真严格的实验操作 实验室环境和实验器具保持干净 戴手套操作、勤换手套 使用带螺纹的管子 使用经过校准的PCR专用加样器 使用带有滤芯的枪头 使用PCR级的水 使用热启动酶 定期用紫外灯照射实验区，电泳区域与样本制备区隔离 认真严格的实验操作 除模板外其他成分预混，用涡旋振荡器混匀 在PCR管中加样时先加模板再加MIX 进行定量PCR前对样品进行离心，除掉气泡 设置无模板的对照 设置重复样本——至少三个重复 PCR管或PCR板要密封好 尽可能使用大的加样体积 (5ul) 相同的试剂，不同人操作 Good Technique Poor Technique Cycle Cycle 实验流程 Aurum Total RNA kit iScript cDNA Synthesis Kit RNA提取 qPCR实验 数据处理 RNA定量 反转录(RT) qPCR实验设计 DNA提取 qPCR预实验 要清楚数据是如何被分析的，要知道数据处理方法的前提假设。 例如使用2-DDCt方法的前提是目的基因和内参照基因的扩增效率都是100% 要验证这些假设 感谢各位光临！ * * AquaPure RNA 分离试剂盒: 无需接触有毒的苯、胍或氯仿等试剂 高速度— 从细胞、组织或血液到纯化的RNA 只需大约30 min 应用广泛的操作流程— 液相操作流程适合范围极广的应用领域 * Verify primer and probe specificity Maximize individual PCR efficiencies Equalize individual PCR efficiencies. FYI on his probes and primer sets for these experiments: All primer pairs were designed to anneal at ~59 oC All probes were designed to anneal at ~68 oC All primer pairs were designed to generate a single fragment of 80-176 bp * * 100mg组织－1ml Trizol 反转录10ul体系，而后取2ul稀释至20ul，加样1ul * * AquaPure RNA 分离试剂盒: 无需接触有毒的苯、胍或氯仿等试剂 高速度— 从细胞、组织或血液到纯化的RNA 只需大约30 min 应用广泛的操作流程— 液相操作流程适合范围极广的应用领域 * Verify primer and probe specificity Maximize individual PCR efficiencies Equalize individual PCR efficiencies. FYI on his probes and primer sets for these experiments: All primer pairs were designed to anneal at ~59 oC All probes were designed to anneal at ~68 oC All primer pairs were designed to generate a single fragment of 80-176 bp * * As a general rule, variation should be less than 0.5 Ct (ideally less than 0.25 Ct) * * r 的绝对值0.990或 R2 值0.980。 10倍连续梯度稀释方法： 1v原液(标准品i) +9v稀释缓冲液，得标准