印第安纳型水泡性口炎病毒核衣壳.PDFVIP

维普资讯 中国动物检疫 2006年第 23卷第 9期 一22一 本栏 目主持人 ：胡藕祥 文章编号：1005—944X(2006)09-0022-03 印第安纳型水泡性 口炎病毒核衣壳 蛋白基因在毕赤酵母表达系统中的表达 陈义平 盛祖勋 )赵永刚 王宝安 王志亮 (中国动物卫生与流行病学中心 国家外来动物疫病诊断中心 青岛 266032) 摘要：将含有 IN型VSV核衣壳蛋白基因的重组质粒 pET一32a／N用EcoRI和NotI进行双酶切，目的基因 克隆到表达载体 pPICZ0A【，构建重组质粒pPICZe~A／N。用SacI酶切线性化 ，并以电转化方法转化受体酵母茵 GS115．PCR证实 目的基因整合到重组酵母茵染色体 中，经鉴定所获得的重组酵母菌株为Muts表型。用甲醇对 重组酵母进行诱导表达．经SDS—PAGE和Westernblot鉴定，核衣壳蛋 白基因在毕赤酵母 中获得表达 ，目的蛋 白分子量大小为约75kDa．表达量约 占茵体总量的20％，并能够被VSV阳性血清所识剐，可用于VSV的血清 学检测。 关键词：水泡性 口炎病毒：核衣壳蛋白基因；毕赤酵母表达系统 水泡性 口炎是由水泡性 口炎病 GS115为本中心保存 。pPICZctA酵 按文献旧方法大量制备阳性重 毒 (VSV)引起的牛、马、猪等多种动 母表达载体购 自Invitrogen公 司。 组质粒，取 510ng用 SacI酶切线 物的水疱性疾病 】1『。人也可感染 ．表 pET一32a／N重组质粒 由本 中心构 性化 。按 Invitrogen公司介绍的方 现类似流感样症状 。该病主要发生 建．含 lN型VSV核衣壳蛋 白基因。 法，用 LiC1制备酵母感受态细胞， 于美洲国家．法国和南非也曾有报 1．2 主要分子生物学和免疫学试 将线性化 的pPICZctA／N转化人酵 道[21。水泡性 口炎病毒 (VSV)属弹状 剂 母菌 GS115菌株中．经 28℃摇床复 病毒科，水泡病毒属，为单股负链不 DNA限制性 内切酶 EcoRI和 苏24h后涂MD平皿 ．置 30℃温 分节段的RNA病毒 ．病毒粒子呈子 NotI，质粒纯化 回收试剂盒 ，DNA 箱培养 24d。 弹状或棒状．有囊膜3『j。核衣壳蛋白 ligation试剂盒，RNaseA、RNasin购 1．5 酵母重组子的鉴定 (N蛋 白)是 VSV的主要结构蛋 白， 自宝生物工程 (大连)有 限公司 ； 1．5．1 酵母基因组提取 接种单菌 具有高度保守性和群特异性．包裹 DNA片段胶纯化 回收试剂盒购 自 落于5mlYPD培养基中．30℃培养 病毒基 因组．并在病毒 的复制过程 上海华舜生物工程有限公司：预染 至 OD6町=6，取 1．5m1菌液 ，1500g 中发挥重要作用4[1 国内外对N蛋 蛋 白Marker购 自Fennentas公司： 离心 10min收集菌体 用 1001~ITE 白基因在大肠杆菌和昆虫细胞内分 羊抗 鼠IgG—HRP为 Sigma公司产 (pH7．0)重悬，加人 300txlEDTA 别进行 了表达5『．并应用表达 的重 品：DAB显色试剂盒为武汉博士德 (pH8．0)，0．07MTds—HC1，3 l8一巯 组抗原建立 了间接 EUSA和竞争 公司产品 基乙醇 ，1txlLyticase，37oC水浴 30 ELISA血清学检测方法 本试验构 1．3 酵母表达质粒 pPICZ~A／N的 min。10000g离心 10min，取沉淀， 建了重组载体 pPICZctA—N．并转化 构建 加 90 lTE重悬。然后用酚、氯仿 GS115酵母菌 ．对 IN型 VSV的N 将 pET一32a／N质粒和 pPICZctA 抽提一次．取水相 。加人两倍体积无 蛋白基因在毕赤酵母中的表达进行 质粒分别用 EcoRI和NotI双酶切 ． 水