新型环形病毒AGV7的VP3基因克隆、表达及其多抗制备.PDF

新型环形病毒AGV7 的VP3 基因克隆、表达及其多抗制备 申秋平，田晓彦，邵红霞，秦爱建，叶建强 （扬州大学兽医学院，江苏扬州，225009） 引言 鸡传染性贫血病毒（CAV ）一直被认为是圆环病毒科中环形病毒属唯一成员。直到2011 年，Rijsewijk 等从发病鸡的血清样品中检测到新型环形病毒序列命名为 AGV2 。同年， Sauvage 等在健康人的皮肤棉试样品中检测到首个与AGV2 高度同源的人源环形病毒HGyV [1] 序列 。自2012 年，其它新型环形病毒包括GyV3，GyV4，GyV5，GyV6，GyV7 等被陆续 [2] 发现鉴定，并具有潜在的公共卫生意义 。然目前尚无检测GyV7 抗原及其抗体的血清学方 法。因此，对GyV7 病毒早期表达蛋白VP3 基因在体外进行克隆，构建VP3 表达载体，实 现其表达，将为深入开展GyV7 蛋白抗原及其抗体检测、血清学调查，明确GyV7 在鸡群以 及人群中的感染复制情况提供有效诊断试剂；并为探究 GyV7 VP3 生物学功能具有重要意 义。 材料与方法 根据pGEX-6p-1，pcDNA3.1-EGFP ，AGV7 -VP3 的序列及相应模版，分别设计并合成 引物扩增出相应线性化载体及基因片段。通过 EXnaseTMII 酶进行体外重组连接克隆，分别 获得GST 融合表达载体pGST-VP3 以及EGFP 融合表达载体pEGFP-VP3 。将pGST-VP3 转 化到BL21 细菌进行IPTG 诱导表达，并对表达的VP3 蛋白进行纯化，免疫小鼠。通过western blot,用转染EGFP 融合表达载体pEGFP-VP3 的293T 细胞，对免疫小鼠制备的抗VP3 多克 隆抗体进行验证，并对AGV7 的VP3 蛋白在HCT116 肿瘤细胞中的定位进行了观察。 结果与讨论 通过EXnaseTMII 酶进行体外重组连接克隆，我们成功获得了AGV7 的GST-VP3 融合表 达产物。利用GST 琼脂糖凝胶柱对可溶的GST-VP3 表达产物进行了纯化，并免疫小鼠成功 获得抗AGV7 的VP3 蛋白的抗体。western blot 免疫印迹证明，制备的抗AGV7 的VP3 蛋 白的小鼠多克隆抗体能与在293T 细胞中表达的EGFP-VP3 融合表达产物进行良好的免疫反 应。荧光共聚焦显微镜观察发现，EGFP-VP3 在HCT116 细胞中表达主要集中在细胞核，且 呈散在点状分布，类似凋亡小体。这些AGV7 VP3 表达载体的构建，表达产物、小鼠多克 隆抗体的获得及其在肿瘤细胞中的表达分布，为进一步研制 AGV7 血清学诊断方法提供了 材料，为深入探究AGV7 VP3 的生物学功能打下了基础。 主要参考文献 [1] Rijsewijk, F. A. et al. Discovery of a genome of a distant relative of chicken anemia virus reveals a new member of the genus Gyrovirus. Archives of virology 156, 1097-1100, doi:10.1007/s00705-011-0971-6 (2011). [2] Zhang W, Li L, Deng X, Kapusinszky B, Delwart E (2014) What is for dinner? Viral metagenomics of US store bought beef, pork,and chicken. Virology 468-470:303-310 [3] SHAO H，FAN Z ，WAN Z ，et al. An efficient and rapid influenza gene cloning strategy for reverse genetics system ［J ］. Journal of Virological Methods，2015 （222 ）：91-94.