项目研究的目的和意义-中国烟草标准化.docVIP

《鲜烟叶样品的制备 液氮法》 研究报告 项 目 来 源： 国家烟草专卖局 合 同 号： 2012B062 承 担 单 位：郑州烟草研究院 起 止 年 限： 2012年6月~2013年6月 2013年5月28日 目 录 一、项目研究的目的和意义 1 二、项目研究前国内外研究进展情况 1 三、本项目开展的技术路线 3 四、本项目开展的试验研究 4 （一） 代谢组学试验—基于LC-Q-TOF/MS、GC/MS烟草鲜烟叶样品的非靶向代谢物分析 4 1 材料与方法 4 1.1仪器设备 4 1.2 试剂 4 1.3 试验材料 4 1.4 试验方法 6 2 结果与分析 7 2.1 2012年大田实验结果与分析 7 2.2 2013年补充试验结果与分析 11 （二） 分子生物学试验—烟草鲜烟叶样品的RNA提取、质量检测和qRT-PCR验证 14 1 材料与方法 14 1.1仪器设备 14 1.2 试剂 14 1.3 试验材料 14 1.4 试验方法 15 2 结果与分析 18 2.1 2012年大田试验结果与分析 18 2.2 2013年补充试验结果与分析 20 （三） 烘烤试验—不同制样方法烟叶烘烤过程中主要大分子物质降解规律研究 27 1 材料与方法 27 1.1试验时间及地点 27 1.2试验材料 27 1.3试验方法 27 2结果与分析 28 2.1淀粉检测结果与分析 28 2.2蛋白质检测结果与分析 29 五、研究结论 31 一、项目研究的目的和意义 样品制备是进行代谢组学、分子生物学等研究的基础，是较为关键的步骤很多文献和不同实验室的经验都证明了这一点。一个好的样品制备是获得真实数据的前提随着烟草基因组计划的开展，烟草代谢组学和分子生物学研究与日俱增。代谢组学研究要求检测植物里所有的小分子代谢产物，代谢物容易受环境的影响，烟草中的酶很容易降解代谢物。分子生物学很多研究如表达谱都是以RNA（核糖核酸）为起始研究对象，然而烟草在生长过程中体内积累了丰富的次生代谢物质，如多糖、多酚、生物碱和蛋白等物质，它们易与RNA共沉淀对RNA的提取和纯化有干扰作用；在RNA提取过程中，RNA极易被内源和外源的RNA酶降解。不同单位采用不同的样品制备方法，会获得大相径庭的结果有的单位对怎样进行样品制备还存在疑惑，不同单位获得的数据之间的可比性较差，浪费了实验经费和时间。所以非常有必要确定烟草鲜烟叶样品制备方法。不同。 二、项目研究前国内外研究进展情况 液氮即液态氮气，为无色透明、无味、无毒之低粘度的透明液体，不导热不导电，不自燃助燃，化学性质稳定，很难与其它物质发生化学反应。液氮在大压力下的沸点为-196，在这样的冷冻条件下，调节和控制细胞生长代谢的各种酶的作用受到极大抑制，细胞内部的生化反应十分缓慢，甚至停止，避免了细胞代谢物、RNA和遗传性状的改变。细胞可在液氮中长期冻存，在最佳条件下活化后，仍可保持其原有的活性。正因为液氮有这些优点，在以下几个领域有着广泛应用，如用于家畜冻配改良技术、家畜和多种动物的胚胎移植与冷冻胚胎制作、微生物菌种保藏、植物种子和离体材料的保藏、食品行业以及医疗行业。 代谢组学是研究生物体系（细胞、组织或生物体）受外界刺激时，产生的所有小分子（分子量小于1000）代谢组分变化的一门科学，它主要对代谢过程中所有小分子代谢产物的组分及变化进行无歧视性高通量分析。代谢组学的概念最早来源于代谢谱分析(Metabolic profiling)，它由Devaux等人于上世纪70年代提出。到90年代后期，随着基因组学的提出和迅速发展，Oliver于1997年提出了代谢组学(metabolomics)的概念，之后很多植物化学家开展了这方面的研究。代谢组学是继基因组（genome）、转录物组（transcriptome）、蛋白质组（proteome）之后快速发展的一门的技术科学。到目前为止，绝大多数代谢组学研究都集中在模式植物拟南芥、水稻上，系统的烟草代谢组学研究工作国际上尚处于空白状态。 代谢组学是目前国际上最为热门的、新兴的生物基础科学研究课题之一。根据PubMed上的查询结果统计，以“metabolomics”或“metabonomics”为关键词的论文从2000年和2001年的6篇和10篇，迅速增加到2008年的613篇和2011年前9个月的565篇；2000年到2006年在Nature、Science和Cell上只有1篇代谢组学为主题的论文，而2007年到2010年在Nature、Science和Cell上发表的研究代谢组学的论文共有7篇。近年国内许多大学和研究所也开展了代谢组的研究，国际代谢组学大会已连续召开7届，同时中国科学家发起召开的国际植物代谢组学已经连续召开2届。在代谢组学方兴未艾之际，科技部于2007年启动