dh基因在毕赤酵母中的表达及溶血活性检测.PDFVIP

研究报告 f=}田钾 副溶血弧菌tdh基因在毕赤酵母中的表达及溶血活性检测 赵永刚1,2战文斌 ，萨仁高娃 ，王君玮2，王志亮2 (1．中国海洋大学教育部 海水养殖重点实验室，山东 青岛 266003；2．中国动物卫生与流行病学中心，山东 青岛 266032；3．中国科学院海洋研究所 海洋地质与环境重点实验室，山东 青岛 266071) 摘要：通过PCR技术A,kg4溶血弧菌(VibrioParahaemolyticus，vP)基因组DNA上扩增耐热溶血素基因 tdh，双酶切后定向插入到酵母表达载体 pPICZaA 中，构建重组表达质粒 pPICZaA—tdh，经限制性内切 酶SacI线性化后 电转化毕赤酵母 (Pichiapastoris，Ppastoris)GS1l5，经PCR和测序鉴定耐热溶血素基 因成功整合到毕赤酵母的基因组 中。在 甲醇诱导下进行 tdh的表达，SDS．PAGE 分析证明重组 TDH (thermostabledirecthemolysin，TDH)的分子质量约为 23ku，经 Westernblotting鉴定VP抗体能与表 达的 TDH 发生特异反应，说明 tdh基因在毕赤酵母 中的表达是准确的。溶血实验证 明了表达的 TDH 具有溶血活性。本研究首次应用毕赤酵母表达耐热溶血素基 因 tdh，在培养基中获得分泌表达的 耐热溶血素，为研 究tdh基因的功能奠定了基础 。 关键词：耐热溶血素；分泌表达；毕赤酵母；溶血活性 中图分类号：P714+．5 文献标识码：A 文章编号：1000—3096(2010)09—0010—05 VP是中国对虾(Fenneropenaeuschinensis)的病 母表达系统中的高效、可溶性 、分泌型表达，获得了 原菌，引起对虾红腿病；该菌也能感染养殖蟹类与 高效表达抗原，并对其溶血活性进行 了初步研究， 贝类，导致养殖蟹类及贝类 的大量死亡；此外，VP 并为制备抗 TDH的多克隆抗体或单克隆抗体及基因 对网箱养殖大黄鱼fPseudosciaenacrocea)，的致病性 功能的研究打下基础。 己有较多的报道，主要引起体表充血及肠炎的症状， 1 材料与方法 在高温季节造成大量的死亡：因此，该菌是养殖水 产动物的重要条件性病原。具有致病性 的菌株还能 1．1 菌株与质粒 导致：(1)食物中毒：尤以 日本 、东南亚、美国等国 副溶血弧菌(HbrioParahaemolyticus，VP)、大肠杆 家多见，也是我 国沿海地区及台湾省食物中毒最常 菌(Escherichiacoli)JM109由本实验室保存，EasySe． 见的一种病原菌；(2)急性腹泻病：是发展中国家急 1ectPichiaExpressionKit购 自Invitrogen公司。 性腹泻病的主要病原体之一，占分离菌株的 20％以 1．2 试剂与工程酶 上 【；(3)旅游者腹泻：日本学者在 Osaka和 Kansai 飞机场卫生检疫站从出国旅游旅客 ExTaq聚合酶、pMD18-T试剂盒 、DNAMarker 中共发现 84777名腹泻患者，其中由副溶血性弧菌 DL2000、DLI5000、限制性内切酶 XhoI、XbaI、 所致者为 1959人[2；(4)其他：如反应性关节炎(该菌 SacI，DNA 回收试剂盒 、T4DNA连接酶均购 自大连 能产生 HSP60)[3]和心脏疾病等 4¨】。目前研究认为副 宝生物工程公司；SDS、丙烯酰胺、叉丙烯酰胺、 溶血性弧菌的致病 因子包括细菌产生的毒素 (溶血 TEMED 等购 自