R检测猪口蹄疫病毒猪水泡病.PDFVIP

维普资讯 中国动物检疫 2006年第 23卷第 3期 一24 一 目主持人：胡藕祥 文章编号：1005—944X(2006)03—0024—03 多重 RT—PCR检测猪 口蹄疫病毒 猪水泡病 病毒和猪水疱性口炎病毒的研究 祁会彩 12·)龚振华 ’)杨增岐2)郑增忍’)潘康锁铘 李 葳 ’)黄秀梅 1)郭福生 ’)蒋正军’) (1农业部动物检疫所 山东 青岛 266032；2西北农林科技大学 动物科技学院 陕西 杨凌 712100； 3陕西省畜牧兽 医总站 西安 7100l6) 摘要：建立了一种同时检测猪 口蹄疫病毒 (FMDV)、猪水泡病病毒(SVDV)和猪水疱性 口炎病毒 (vsv)三 种病原体的多重RT—PCR方法。参照文献报道的基因序列，设计合成了三对特异性引物：PCR扩增条件进行 优化后，用这三对引物对同一样品中的FMDV、SVDV、VSVRNA模板进行扩增，结果同时得到了三条特异性 条带，大小与试验设计相符：FMDV (208bp)、SVDV (862bp)、VSV (638bp)，且对猪瘟病毒 (CSFV)、猪繁殖与 呼吸综合症病毒(PR_RSV)和猪传染性 胃肠炎病毒(TGEv)核酸扩增结果为阴性；三种病毒RNA模板检出的最 小量均为 1O 。试验证 明，此方法经济、快速、敏感、特异 ，可用于FMDV、SVDV和 VSV这三种猪水泡性疾病的 鉴另q诊断及流行病学调查 关键词：多重PCk；猪 口蹄疫病毒：猪水泡病病毒；猪水疱性 口炎病毒 口蹄疫、水疱性 口炎和猪水泡 感性 。而且快速省力。 下游 引物 ：5’一GCCTGT 病这三种疾病被O1E列为A类传 l 材料与方法 GGT 个丌 CAT GGTTGT 一3’ 染病．不但严重影响了畜牧业的发 1．1 毒株和核酸来源 VSV 上游引物 ：5’一GTCAAG 展．而且对人体健康也存在着极大 FMDV、SVDV、VSV,CSFV四种 AGA ATC AI GAC一3’ 的威胁．是世界各国检疫和防疫的 无感染性病毒核 酸 ．PRRSV 和 下游引物 ：5’一GqT CCG 重点对象u【。这三种疾病都能使猪的 TGEV均为本实验室保存 TAT CTG AAC GA一3’ 口、蹄、乳房及皮肤处产生水泡，临 1．2 工具酶和试剂 1．4 病毒 RNA的提取 床特征及病理变化都十分相似。临 反转录酶(M—MLV)、RNA抑制 将病毒的细胞培养液各取 100 床上很难区分．需采取水泡液、水泡 剂 (RNasin)、Taq酶 、dNTP、Di2，000 L，分别放入 1．5ml的无菌离心管 皮、痂皮和血清等送实验室做鉴别 DNAMarker等反转录试剂和 PCR 内．加入 500IxLTrizo1．混匀后室温 诊断[21使用常规的病原学和血清学 试剂．均购 自Promega公司 放置 15rain．吹打使细胞破碎，加入 检测方法+不但耗时长，而且过程繁 l1．3 引物设计与合成 100 L氯仿 。振荡混匀后 。室温放 琐 ：利用多重 RT—PCR可以同时检 根 据 genebank中 已发