核酸分析.ppt

第四章核酸分析 ; 核酸(Nucleic Acid)包括DNA和RNA两种，是由碱基、戊糖和磷酸三者组成。; 与DNA相比，RNA的结构较为简单，它主要是以单链形式存在，有时也能形成局部的双链发夹式结构。它的一般功能是翻译，转录DNA分子所含的信息，指导蛋白质的合成。;4.1. 脱氧核糖核酸及核糖核酸的结构 核酸是由大量的核苷酸单体以聚合方式组成的极长的线状聚合物。不同核酸的核苷酸数目可以从80(转移核糖核酸，tRNA)个碱基对大到108个碱基对。 表示双链和单链核酸大小的单位分别为碱基对(bp，basepare)和碱基(b，base)，kbp和Mbp分别代表1 000和1000000个碱基对，而1kb则代表l 000个碱基。例如，噬菌体染色体的大小为4MbP，分子量大约为3×lo9，长度为1.5mm。DNA比RNA大得多，如人细胞核最小的DNA分子中碱基对数目为4.5Mbp，最大的RNA分子仅含50 kb，二者相差约1000倍。;4.1.1 碱基、核苷及核苷酸 核苷酸是核苷的磷酸酯，它们是脱氧核糖核酸(DNA)及核糖核酸(RNA)的组成单元。RNA的组成单元是核糖核苷酸，而DNA的组成单元是2’—脱氧核糖核苷酸。;由碱基和核糖结合所形成的?-糖苷类化合物称为核苷。;4.1.2 DNA的结构 DNA的一级结构 DNA由两条互补的单链DNA组成，每条单链都是脱氧核苷酸间以磷酸二酯键连接起来的，为了书写的方便，因常在描述DNA一级结构时可用一些简单的方式来表示。;如左图DNA片段，可表示为5’-dpApGpCpTpG-3’，或d(pAGCTG)，式中的d代表脱氧核糖，p代表磷酸，当p写在碱基英文字母缩写右边时为C－3位OH基被酯化，写在左边时为C－5位OH基被酯化。一般为了更为方便起见，就简单地写为AGCTG，其方向规定为5’～3’方向。;DNA的二级结构 DNA的二级结构指DNA分子的空间结构，即三维空间的结构。;DNA双螺旋结构模型及碱基配对的示意图; DNA的三级结构 DNA的三级结构是指双螺旋链的扭曲，包括多重螺旋、分子内单链形成的环等等。其中超螺旋是最常见的结构。一些病毒DNA是单股螺旋．而绝大多数天然DNA是双股螺旋。不论是单股还是双股螺旋都可能形成闭环而失去自由的3’和5’末端。闭环分子大多数都会扭转成为三维螺旋结构，也就是DNA分子的三维结构，一般称作超螺旋(Supercoil or Superhelix);电镜下观察到的噬菌体PM2的超螺旋结构 (a)图为松弛环DNA，(b)图为超螺旋DNA;4.2 核酸的定量及结构分析 核酸是最重要的一类生物大分子，它与自然界中的各种生命活动都有着非常密切的关系。其含量的变化或结构的微小变化都可能导致意想不到的后果，如各种与基因相关的疾病的发生。可以说，该酸化学是现代分子生物学的主要研究内容。而所有这些研究工作都离不开核酸的分析问题，有时需要简单的定量，有时需要研究核酸结构的各种变化，等等。因此，核酸分析化学实际上是打开与核酸相关的各种难题的一把金钥匙，各种方法的研究具有重要的理论意义和实际应用价值。;4.2.1免疫化学法 原理 有些构型的DNA(如左手螺旋DNA，Z-DNA)经化学修饰可以诱导产生高特异性的抗体，所产生的抗体可以用作分析这些核酸的免疫化学试剂。免疫化学方法尤其适合于DNA结构及DNA化学修饰的分析，如DNA与致癌物所形成的加成物的分析。抗DNA抗体对于高特异性确定各种碱基及构型，检测不同构型DNA间的转化，及在复杂的细胞环境下DNA的化学修饰都是非常有用的。;抗体制备 在实验中可采用两种免疫原来诱导单克隆或多克隆抗体。第一种免疫原是DNA与带正电荷的载体蛋白间所形成的非共价络合物，甲基化的牛血清白蛋白是常用的载体之一；另一种类型的免疫原是通过不同的方式将核酸组分(核苷酸、核苷或碱基)与载体蛋白共价连接而获得。除了实验免疫之外，动物或人的自身免疫疾病所产生的血清也可作为核酸抗体的一种来源。;分析方法 用于检测抗体与DNA复合物的方法包括凝胶免疫扩散法，沉淀法，絮凝法，络合物的电镜分析法，酶联免疫吸附分析法(ELISA)．放射免疫分析法(RIA)和凝胶位移分析法等。;; 产生上述三类光谱的来源不同，因而各类方法的灵敏度也就有很大的差别。一般来说，电子光谱的灵敏度比振动光谱或NMR光谱高1－2个数量级。也就是说．在使用振动光谱或NMR光谱时所需要的样品的浓度要比电子光谱时高1—2个数量级。另一方面，电子光谱不像振动光谱那样具有很强的特征性，当使用电子光谱时一般只利用了一种类型的生色基，如核酸碱基或其它类型的吸收配基．面振动光谱可以提供核酸碱基及糖—磷酸酯骨架的各种类型化学键的吸收。