花楸成熟种胚组织培养方法探究.docVIP

花楸成熟种胚组织培养方法探究材料与方法 1.材料 本试验中以花楸成熟种胚为外植体，种子采于黑龙江植物园的花楸成熟果实，调制后在4℃冰箱中贮存。将材料用自来水浸泡18h，然后用70%的酒精浸泡30s，再用2%的NaClO溶液搅拌消毒处理10min，然后在无菌工作台上用无菌水冲洗5～7次，再用解剖刀切破种皮子叶端，剥出成熟胚待接种之用。 2.方法 1)不定芽的诱导：把成熟胚接种在附加了不同浓度的6-BA（6-苄基氨基嘌呤）、NAA（萘乙酸）的MS和WPM固体培养基上。每组激素组合接种6瓶，每瓶接种5个种胚。观察不定芽生长状况，并在第20天开始统计不定芽诱导率。根据不定芽诱导率，选择最佳培养基与激素组合。2)不定芽的增殖：观察不定芽生长状况，当不定芽生长0.5cm时转接到附加了不同质量浓度的6-BA、IAA激素的MS增殖培养基上进行培养。3)不定芽的生根：将增殖到长度1.0～1.5cm的不定芽接种到附加了不同质量浓度的IBA或NAA的1/2MS培养基上，进行生根培养。4)培养条件：采用日光灯照射进行光照培养，光照16h，黑暗8h，光强2000～3000lx，温度(25plusmn;1)℃，湿度70%～80%。5)数据统计：通过统计不定芽和生根的数量，分别计算出不定芽诱导率和生根率。不定芽诱导率＝（诱导出不定芽外植体数/接种的外植体总数）times;100%；生根率＝（生根不定芽数/接入不定芽总数）times;100%。 结果与分析 1.不同处理对花楸种胚不定芽诱导的影响 1)不同基本培养基对花楸种胚不定芽诱导的影响：将接种在MS和WPM培养基上的花楸成熟种胚培养7d后，胚芽膨大，3周后部分成熟胚胚芽处出现不定芽。1个月后，不同培养基中花楸成熟胚不定芽诱导率出现差异，诱导不定芽3周后统计诱导情况。在MS培养基中，不定芽诱导率为80.33%；在WPM培养基中，不定芽诱导率为60.00%。经过X2分析得出，MS和WPM培养基上产生的不定芽诱导率之间有显著差异，即eta;＝4.02＞Xalpha;＝3.84。结果指出MS培养基对不定芽的诱导效果优于WPM培养基。 2)不同激素质量浓度组合对花楸种胚不定芽诱导的影响：通过对激素质量浓度组合筛选，本试验中选择了不同质量浓度的6-BA、NAA组合研究其对不定芽诱导的影响。将花楸成熟种胚培养12d后，观察到生长很好的嫩绿不定芽，3周后部分不定芽长到1～2cm。1个月后，不同激素质量浓度组合处理中花楸成熟胚不定芽的诱导率出现差异。由表2可以看出，在附加NAA0.5mg/L和6-BA0.5mg/L的MS培养基中，不定芽诱导率最高达80.33%，经过X2分析得出，激素质量浓度组合5与组合1、3、4、6、7、9之间芽诱导率均有显著差异（X0.05=3.84），即eta;1-5=7.50＞X0.05、eta;3-5=6.20＞X0.05、eta;4-5=5.08＞X0.05、eta;5-6=6.20＞X0.05、eta;5-7=10.33＞X0.05、eta;5-9=5.08＞X0.05，而其它各组合之间的芽诱导率无显著差异。在附加NAA1.0mg/L和6-BA0.5mg/L的WPM培养基中，诱导率最高为60.00%，经过X2分析得出，激素质量浓度组合6与组合1、2、8、9，组合2与组合7之间芽诱导率均有显著差异，即eta;1-6=5.45＞X0.05、eta;2-6=4.29＞X0.05、eta;5-8=4.29＞X0.05、eta;5-9=6.78＞X0.05，而其它各组合之间芽诱导率无显著差异。 2.不同激素质量浓度组合对花楸种胚不定芽增殖的影响 经初代培养诱导不定芽，把不定芽转接到附加了不同质量浓度的6-BA、IAA的MS增殖培养基上进行培养，经过2周可进一步诱导增殖出5～13个不定芽，与初代培养诱导不定芽的情形相似。培养中，如激素6-BA质量浓度过高会出现玻璃化现象，在后期抑制根的生长。不同激素质量浓度组合对不定芽增殖的影响见表3。从表3可以看出，不定芽增殖的最佳激素组合和质量浓度为IAA0.5mg/L＋6-BA0.2mg/L。 3.不同质量浓度的激素对花楸种胚不定芽生根的影响 待不定芽高1.0～1.5cm时，从基部剪下，移至生根培养基中，5d后芽基部陆续出现白色突起或愈伤组织，10～15d后可见发达的白色、黄绿色或红色主根，1个月后大量须根产生，并形成发达的根系。激素IBA质量浓度对生根数量的影响如表4所示。在1/2MS培养基中，IBA质量浓度为0.2mg/L，根数量最大，不定根诱导率为70%，根长随着IBA质量浓度的逐渐增高而渐渐变短，当IBA质量浓度为0.2～0.3mg/L时，根长差别不大，然后根长逐渐变大，从根的生长状态来看，添加IBA的处理中