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凝胶法细菌内毒素检查介绍【摘要】简单介绍一种广泛使用，权威的细菌内毒素检测方法─凝胶法 【关键词】凝胶法；细菌内毒素；鲎试剂；细菌内毒素检查用水 1概述 在药品药理检测中，目前有两种常用的热原检测方法-细菌内毒素法（鲎试剂法）和家兔法。细菌内毒素检查包括凝胶法和光度测定法两种方法，其中广泛使用，权威的检测方法为凝胶法。 2细菌内毒素检查法的建立 1956年美国人Bang发现美洲鲎血液遇革兰氏阴性菌时会产生凝胶。其后Levin和Bang又研究出微量革兰氏阴性菌内毒素遇鲎血液也可以引起凝胶反应，从而创立了鲎试剂检测法。 《中国药典》2010年版规定的细菌内毒素检测法系利用鲎试剂来检测或量化由革兰阴性菌产生的细菌内毒素，以判断供试品中细菌内毒素的限量是否符合规定的一种方法。 3实验原理 细菌内毒素在钙离子，镁离子参与下，激活鲎试剂中c因子，活化的c因子激活b因子，活化的b因子激活凝固酶原生成凝固酶，促使凝固蛋白原生成凝固蛋白，在支联酶作用下形成凝胶。 4试验试剂 鲎试剂：从栖生于海洋的无脊椎动物“鲎”的蓝色血液中提取的变形细胞溶解物，经低温冷冻干燥精制而成的生物制剂。鲎试剂的生物活性以其能检出细菌内毒素的最低有效浓度表示。 鲎试剂的灵敏度是用细菌内毒素来标定的，因此标定鲎试剂灵敏度所用的细菌内毒素必须是统一且标准的。 5实验用具 凝胶法细菌内毒检查所需实验用具：移液管（或刻度吸管，定量移液器）、三角瓶、小试管（16×100mm）、试管架、洗耳球、封口膜或金属试管帽、时钟、脱脂棉、吸水纸、剪刀砂轮。所有玻璃器皿或金属用具须采用干热灭菌法250℃干烤30分钟以上（2010版中国药典规定）以除去细菌内毒素。塑料用具应使用其它适宜的除细菌内毒素方法。 6实验用试剂 实验所用的主要试剂有：75%乙醇、蒸馏水、铬酸洗液。 7实验操作方法 7.1试验准备 7.1.1洗液的配备配制铬酸洗液或其他适宜的细菌内毒素灭活剂。 7.1.2玻璃器皿的洗涤将洗涤的玻璃器皿用洗涤剂和自来水洗净并空干水分后置洗液中浸泡4小时，取出，用自来水将残余的洗液洗净，再用新鲜蒸馏水冲洗干燥后置适宜的密闭金属容器中，置烤箱中250℃干烤30分钟以上。达到时间后，关断电源。待烤箱温度自然降至室温，在不开启金属容器的情况下，可两周内使用，否则须再次加热除去可能存在的外源性内毒素。塑料制品清洗干净后在30％双氧水中浸泡4 h，再用无热原水充分冲洗后在60℃烘箱中烘干备用 。 7.2鲎试剂灵敏度的复核 7.2.1内毒素标准溶液的制备取细菌内毒素标准品一支，轻弹瓶壁，使粉末落入瓶底，再用砂轮在瓶颈上部轻轻划痕，用75%酒精棉球擦拭后启开，防止玻璃屑落入瓶内。然后按标准品使用说明书要求用移液管加入规定量的细菌内毒素检查用水溶解其内容物，用封口膜将瓶口封严。置旋涡混合器上混合15分钟，然后制备成所需浓度的细菌内毒素标准溶液即2.0λ、1.0 λ,0.5 λ, 0.25λ（λ为所复核鲎试剂的标示灵敏度），每稀释一步均应在旋涡混合器上混合30秒。 7.2.2鲎试剂的复核取0.1ml/支的鲎试剂18支轻弹瓶壁，使粉末落入瓶底。用砂轮在瓶颈处轻轻划痕，用75%乙醇棉球擦拭后启开备用，加入0.1ml检查用水，使鲎试剂充分溶解，避免产生气泡。将已充分溶解的待复核鲎试剂18支放在试管架上，排成5列，其中4支4列分别加入2.0λ、1.0λ、0.5λ、0.25λ的内毒素标准溶液；2支1列分别加入 检查用水，作为阴性对照。内毒素标准溶液和检查用水加样量均为0.1ml/支。加样结束后，用封口膜封口，轻轻混匀，避免产生气泡，连同试管架放入37摄氏度水浴中，试管架保持水平状态，保温60±2分钟。 7.3供试品细菌内毒素的检查下面以0.9％的氯化钠注射液为例，介绍凝胶法细菌内毒素的检查。 供试品的制备:取0.9％的氯化钠注射液0.1ml加入到两支小试管内，再加入0.5 EU/ML的鲎试剂0.1ml，作为样品管。 阴性对照的制备：取检查用水0.1ml加入到两支小试管内，再加入0.5 EU/ML的鲎试剂0.1ml，作为阴性对照管。 阳性对照的制备：取10EU/支的细菌内毒素标准品1支，加检查用水1ml，在旋涡混合器上混合15分钟，然后从中取细菌内毒素标准品溶液0.2 ml加入到小试管内，加检查用水1.8ml，在旋涡混合器上混合30秒，配制成浓度为1 EU/ML的细菌内毒素工作标准品。取0.1 ml细菌内毒素工作标准品加入到两支小试管内，再加0.5 EU/ML的鲎试剂0.1ml，作为阳性对照管。 将以上制备好的试管溶液，用封口膜封闭管口，垂直放入37±1℃水浴或适