兽疫链球菌透明质酸分解酶基因的敲除.pdf

中国生物工程杂志　ＣｈｉｎａＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２００９，２９（１２）：９４～９９ 兽疫链球菌透明质酸分解酶基因的敲除 崔亚娜　苏旭东　王　羽　马晓燕　王雪静　林　杨　张　伟 （河北农业大学食品科技学院　保定　０７１００１） 摘要　以透明质酸分解酶基因（Ｈｙｌ）为改造目标，利用同源重组技术获得 Ｈｙｌ基因敲除的重组 菌。首先以兽疫链球菌的基因组ＤＮＡ为模板扩增出部分透明质酸分解酶基因（Ｈｙｌ１），然后将其 克隆到载体ｐＭＤ１９Ｔ上，再以质粒ｐＵＣ１９为模板，ＰＣＲ扩增得到氨苄青霉素抗性基因，通过反向 ＰＣＲ将其插入Ｈｙｌ１基因的中部，得到基因敲除载体ｐＭＤ１９ＴＳＡ。该载体与质粒ｐＢＲ３２２分别用 ＥｃｏＲ 、Ｐｓｔ 双酶切后进行连接，得到基因敲除的重组载体ｐＢＲ３２２ＳＡ，ＰＣＲ及限制性酶切分析， Ⅰ Ⅰ 构建的敲除载体与设计结果相符。最后，利用这两种敲除载体通过同源重组技术得到一株重组 菌，经ＰＣＲ及酶活鉴定，这株菌的Ｈｙｌ基因已缺失。 关键词　兽疫链球菌　Ｈｙｌ基因　反向ＰＣＲ　基因敲除载体　重组菌 中图分类号　Ｑ７８４ 　　透明质酸（ｈｙａｌｕｒｏｎｉｃａｃｉｄ，ＨＡ）是一种广泛地存在 酶基因Ｈｙｌ１，并以此为基础构建了基因敲除载体，通过 ［１］ 同源重组用体外突变失活的Ｈｙｌ１基因代替兽疫链球 于动物的各种组织内的粘多糖 ，由葡萄糖醛酸 （ＧｌｃＡ）和Ｎ乙酰氨基葡萄糖（ＧｌｃＮＡＣ）以 １３和 １ 菌染色体上正常的Ｈｙｌ１基因，导致整个 Ｈｙｌ基因失 β β ４糖苷键连接成的二糖单元重复构建而成，分子量在数 活，并通过ＰＣＲ和酶活测定试验对透明质酸分解酶缺 十万到数百万之间。高分子 ＨＡ具有许多重要的生理 陷型菌株进行了验证。 功能，被广泛应用于医药、化妆品、食品等领域［２］。近 １　材料与方法 年来，随着ＨＡ的用途日益增多，市场对ＨＡ的需求量 也不断增大。工业上生产ＨＡ主要以发酵法为主，目前 １．１　材　料 我国已有工厂利用发酵法生产ＨＡ，但由于还存在生产 １．１．１　菌种和质粒　大肠杆菌 ＪＭ１０９（ＴａＫａＲａ公 菌株产酸水平较低，生产规模较小，生产成本较高等问 司）、兽疫链球菌（实验室保存）、ｐＭＤ１９Ｔ、ｐＵＣ１９及 题，因此选育高产ＨＡ菌种的工作意义重大。 ｐＢＲ３２２质粒均购于ＴａＫａＲａ公司。 １．１．２　试剂　各种内切酶如ＥｃｏＲ 、Ｐｓｔ 、Ｎｃｏ 及 　　ＨＡ发酵工业中常用的菌种主要为链球菌属，其中 Ⅰ Ⅰ Ⅰ 最常见的是兽疫链球菌。作者在利用兽疫链球菌发酵 ＴａｑＤＮＡ聚合酶、Ｔ４连接酶、琼脂糖凝胶 ＤＮＡ回收试 生产ＨＡ的研究中发现，导致ＨＡ得率下降的主要原因 剂盒和质粒ＤＮＡ小量纯化试剂盒（均购于ＴａＫａＲａ公 是兽疫链球菌中存在透明质酸分解酶，它可以将ＨＡ分 司）；溶菌酶、蛋白酶 Ｋ、ＲＮａｓｅ、碱性磷酸酶、氨苄青霉 解。因此，选育透明质酸分解酶缺陷型菌株是ＨＡ高产 素、四环素、各种ＰＣＲ引物（上海生物工程技术公司）； 菌株选育过程中极重要的一步。近年来，随着一些微 透明质酸酶（Ｓｉｇｍａ）。 ［３，４］ １．２　方　法 生物透明质酸分解酶基因（Ｈｙｌ）序列的报道 ，根据 ［５～９］ １．２．１　兽疫链球菌基因组ＤＮＡ的提取　将兽疫链球 基因工程原理利用基因敲除的方法达到上述目的 ， 越来越被人们重视，本研究即根据公布的兽疫链球菌