重组巴氏杆菌透明质酸合成酶的克隆 - 《中国药科大学学报》！.pdf

学 报 ＪｏｕｒｎａｌｏｆＣｈｉｎａＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　２００９，４０（６）：５４９－５５２ ５４９ 重组巴氏杆菌透明质酸合成酶的克隆、表达及活性鉴定 彭　辰，葛　昊，何书英，高向东 （中国药科大学生命科学与技术学院，南京２１０００９） 摘　要　目的：构建重组巴氏杆菌透明质酸合成酶（ｒＰｍＨＡＳ）原核表达系统，获取高纯度、有活性的ｒＰｍＨＡＳ。方法：利 用大肠杆菌ＢＬ２１ｐＥＴ３２ａ（＋）表达重组蛋白，镍亲和柱纯化，夹心竞争ＥＬＩＳＡ法检测酶活性。结果：Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｔｉｎｇ检测 显示特异性条带，重组蛋白正确表达，镍亲和柱纯化后得到重组蛋白的纯度可达９０％。结论：成功构建了ｐＥＴ３２ａ（＋）／ ｒＰｍＨＡＳ重组质粒并实现了目的蛋白高效可溶表达，为ＰｍＨＡＳ性质相关研究及单一相对分子质量寡聚透明质酸的合成奠 定了基础。 关键词　ｒＰｍＨＡＳ；表达；纯化；活性鉴定 中图分类号　Ｑ９６６　　文献标识码　Ａ　　文章编号　１０００－５０４８（２００９）０６－０５４９－０４ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒｃｌｏｎｉｎｇ牞ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎａｎｄｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｈｙａｌｕｒｏｎａｎ ｓｙｎｔｈａｓｅｆｒｏｍＰａｓｔｅｕｒｅｌｌａｍｕｌｔｏｃｉｄａ  ＰＥＮＧＣｈｅｎ牞ＧＥＨａｏ牞ＨＥＳｈｕｙｉｎｇ牞ＧＡＯＸｉａｎｇｄｏｎｇ ＳｃｈｏｏｌｏｆＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅ＆Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ牞ＣｈｉｎａＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ牞Ｎａｎｊｉｎｇ２１０００９牞Ｃｈｉｎａ Ａｂｓｔｒａｃｔ　Ａｉｍ牶Ｔｏｓｅｔａｓｕｉｔａｂｌｅｒｏｕｔｅｆｏｒｅｆｆｉｃｉｅｎｔｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎａｎｄｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｈｙａｌｕｒｏｎａｎｓｙｎ ｔｈａｓｅｆｒｏｍＰａｓｔｅｕｒｅｌｌａｍｕｌｔｏｃｉｄａ牗ｒＰｍＨＡＳ牘Ｍｅｔｈｏｄｓ牶ＣｏｄｉｎｇｓｅｑｕｅｎｃｅｓｗｅｒｅｃｌｏｎｅｄａｎｄｅｘｐｒｅｓｓｅｄｉｎＥｓｃｈｅ ｒｉｃｈｉａｃｏｌｉｓｔｒａｉｎｏｆＢＬ２１牗ＤＥ３牘ＴｈｅｎｒＰｍＨＡＳｗａｓｐｕｒｉｆｉｅｄｔｈｒｏｕｇｈａｓｉｍｐｌｅＮｉａｆｆｉｎｉｔｙｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙａｎｄ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄｂｙｈｙａｌｕｒｏｎｉｃａｃｉｄｂｉｎｄｉｎｇｐｒｏｔｅｉｎ牗ＨＡＢＰ牘ｂａｓｅｄＥＬＩＳＡａｓｓａｙＲｅｓｕｌｔｓ牶Ｈｉｇｈｙｉｅｌｄｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｒＰｍＨＡＳｅｘｃｅｅｄｉｎｇｔｈｅｈｉｇｈｅｓｔｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｒｅｐｏｒｔｅｄｈｉｔｈｅｒｔｏｗａｓａｃｈｉｅｖｅｄ牞ａｎｄｔｈｅｐｕｒｉｔｙｏｆｒＰｍＨＡＳ ｗａｓａｓｈｉｇｈａｓ９０％Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ牶Ｉｎｔｈｉｓｓｔｕｄｙ牞ａｎｏｐｔｉｍｉｚｅｄｓｙｓｔｅｍｏｆｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ牞ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎａｎｄｉｄｅｎｔｉｆｉｃａ ｔｉｏｎｒｏｕｔｅｆｏｒｌａｒｇｅｓｃａｌｅｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎｏｆｒＰｍＨＡＳｗａｓｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ牞ｗｈｉｃｈｗｉｌｌｂｅｈｅｌｐｆｕｌｆｏｒａｃｃｅｌｅｒａｔｉｎｇｆｕｒｔｈｅｒ ｓｔｕｄｙｏｆＰｍＨＡＳａｎｄｆａｃｉｌｉｔａｔｉｎｇｆｉｎｅｒｅｓｅａｒｃｈｅｓｏｎｐｅｃｕｌｉａｒｈｙａｌｕｒｏｎｉｃａｃｉｄｗｉｔｈｓｐｅｃｉａｌｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ Ｋｅｙｗｏｒｄｓ　ｒＰｍＨＡＳ牷ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ牷ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ牷ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ＴｈｉｓｓｔｕｄｙｗａｓｓｕｐｐｏｒｔｅｄｂｙｔｈｅＰｒｏｊｅｃｔｓｕｐｐｏｒｔｉｎｇＴａｌｅｎｔｓｉｎＳｉｘＦｉｅｌｄｓｉｎＪｉａｎｇｓｕＰｒｏｖｉｎｃｅ牗Ｎｏ２００８０３３牘 　　透明质酸（ｈｙａｌｕｒｏｎｉｃａｃｉｄ，ＨＡ）是由 Ｄ葡萄 的热点之一。ｒＰｍＨＡＳ可在体外合成相对分子质 β ［４－６］ 糖醛酸（ＧｌｃＵＡ）和 ＤＮ乙酰氨基葡萄糖（Ｇｌｃ 量较小的ＨＡ ，通过对其糖基转移酶功能基因 β ＮＡｃ）的