【Y2H操作方法-HXY整理】.docVIP

实验步骤说明**： 1. 诱饵质粒pGBKT7-bait的构建 2.诱饵融合蛋白BD-bait对AH109酵母的自激活作用及毒性的检测【重要的前期准备】 3. 人胰腺cDNA文库的滴定和扩增【不用做了，直接用质粒】 4. 转化AH109酵母后转化子（阳性克隆）的筛选【顺序转化或共转化】 5. 蛋白质相互作用的验证【一对一验证】 ** 2.诱饵融合蛋白BD-bait对AH109酵母的自激活作用及毒性的检测 2.1 LacZ自激活的检测. 2.2 HIS3自激活的检测 2.3 融合蛋白对酵母菌的毒性检测 4. 文库转化AH109酵母后转化子的筛选 ? 4.1 文库质粒转化pGBKT7-bait/AH109酵母 ? 使用标准的PEG/LiAc转化法将文库质粒转化入已含有pGBKT7-bait质粒的AH109酵母，涂布在SD-Ade-His-Leu-Trp平板上进行重组子筛选 ? 4.2 报告基因ADE2、HIS3和lacZ激活的验证 ? ADE2、HIS3的激活：酵母能够在SD-Ade-His-Leu-Trp平板生长 ? LacZ的激活：β-半乳糖苷酶显色反应呈蓝色 ? 4.3 pACT2-cDNA质粒的获取： ? ①从酵母中抽提质粒，得到pGBKT7-bait和pACT2-cDNA的混合物 ? ②转化E. coli，涂布在含Amp的LB平板上，由于质粒不相容性，转化子中便只含有pACT2-cDNA质粒 ? ③从转化成功的E. coli中抽提出pACT2-cDNA质粒 5. 蛋白质相互作用的验证【一对一验证】 5.1 由于酵母双杂交的假阳性很普遍，所以筛选得到相互作用蛋白的cDNA序列之后，还应将分离出的各种pACT2-cDNA再次单独转化pGBKT7-bait/AH109酵母，即一对一验证，再次检测它们对报告基因的激活情况，排除假阳性 5.2 将pACT2-cDNA质粒送测序，得到cDNA片段的序列，在NCBI数据库Blast查出其对应的蛋白质 5.3 另外，还必须分析这些pACT2-cDNA质粒的构建情况。由于商品文库构建的特殊性，要特别关注这些插入的cDNA片段是否发生了frameshift 5.4 在上述验证都通过的情况下，仍然需要用诸如免疫共沉淀、GST-pull down、细胞共定位等实验来对这些相互作用来进行验证 具体的操作步骤请仔细参看clontech公司的这三个操作手册：  相关质粒载体【更多详细信息见质粒图谱】 酵母双杂交系统3的质粒信息 Fusion 表位酵母筛选标记 细菌筛选标记 Cloning vectors pGBKT7 DNA/bait c-Myc TRP1 kanamycin Control vectors pCL1 GAL4 LEU2 ampicillin pGBKT7的多克隆位点图谱 pCL1质粒图谱 另外附上：文库质粒的载体pACT2 和 AD-prey构建的载体pGADT7的信息：  实验所用菌株基因型及其用途 菌株 基因型 用途 E coli DH5α F-ф80dlacZ△M15 recAl endAl gurA96 thi-1 hsdR17(rk-mk+) supE44 relA1 deoR △（lacZYA-argF）U169 用于质粒的扩增与转化 AH109 MATa, trp1-901, leu2-3, 112, ura3-52, his3-200, gal4, gal80???LYS2 : : GAL1UAS-GAL1TATA-HIS3, GAL2UAS-GAL2TATA-ADE2, URA3 : : MEL1UAS-MEL1 TATA-lacZ 用于酵母双杂交中的诱饵融合蛋白的宿主菌及酵母双杂交筛选 AH109酵母菌的报告基因： AH109酵母菌的表型： 培养液和固体培养基 大肠杆菌培养基及相关试剂 LB培养基： 蛋白胨 10g 酵母提取物 5g 氯化钠 10g 加蒸馏水至1000mL，调整pH到7.0，高温高压灭菌。 固体LB培养基：在液体LB培养基中加入琼脂粉至终浓度1.5-2.0％。 配制抗生素培养基时，氨苄青霉素的最终浓度为60μg/mL，卡那霉素的最终浓度为50μg/mL。 酵母培养基及相关试剂【注意：含有葡萄糖，灭菌时间不要超过20min，一般15min，过长时间导致碳化变黑】 无氨基酸酵母氮源（YNB）为Difco产品；L-Arginine HCl、L-Histidine HCl monohydrate、L-Lysine HCl、L-Uracill购自Sigma；腺嘌呤半硫酸盐（Adenine hemisulfate salt）购自Amresco；其它各种氨基酸均为国产分析纯。 YPD培养液： 蛋白胨