基因操作原重难点总结.docxVIP

基因操作原理重难点总结基因克隆的宏观策略：答：⑴已知序列同源性的基因的克隆(PCR方法克隆目标基因)：根据已知基因序列信息设计引物，以基因组DNA为模板，扩增出目标基因；⑵定位在质粒上的基因克隆：利用识别六碱基的限制性内切酶酶解质粒DNA，电泳分离，然后用特异探针进行杂交，确定基因片段进行克隆；⑶定位在染色体组上的基因克隆：①杂交方法：ⅰ.用识别四个碱基的限制性内切酶对染色体DNA进行部分酶切，建立基因文库。再用标记特异探针进行探测，确定目标基因片断，再进行克隆。ⅱ.利用亚基因文库进行克隆先进行分子杂交，确定基因片断范围，再进行克隆筛选。②免疫抗体法：利用鸟枪法和表达载体建立基因表达文库；利用目标蛋白质制备抗体，对基因表达文库进行筛选，可直接获得完整的基因。③利用简并引物的PCR方法：对目标基因的蛋白质进行N-端氨基酸残基分析。根据氨基酸序列反推目标基因设计简并引物，以基因组DNA为模板进行PCR扩增，获得目标基因。④转座子插入失活克隆法：用转座子对目标生物进行突变，筛选突变株，抽提突变株基因组DNA，利用转座子序列信息设计特异探针，进行TAIL-PCR双向扩增，从而获得完整基因。⑤质粒拯救法：利用带有复制起始位点的转座子进行诱变获得突变株，分离总DNA，酶解、连接、转化和测序。⑥功能克隆法(基因表达产物应有明显的表型效应)：利用目标基因表达产物的表型效应，从基因文库中筛选目标基因。⑦通过双杂交系统克隆新基因：通过靶标蛋白利用双杂交系统克隆与该靶标蛋白作用的蛋白质基因。⑧通过蛋白质组学技术克隆基因：通过肽片断序列获得蛋白质信息，从而在基因组中找到基因位置和序列，根据序列设计引物，扩增克隆该基因。设计从某一生物中克隆某一基因的技术路线：答：原核生物：从样品中抽提总DNA，部分酶切，构建合适载体——将目标DNA片段与载体连接——转入宿主细胞培养——可以根据该目标基因所表现出的特定表型筛选，或是利用核酸探针杂交法、抗体免疫法和差异杂交法筛选。真核生物：提取样品总RNA并分离mRNA——用反转录酶以mRNA为模板合成第一链cDNA——合成第二链cDNA——双链cDNA克隆进质粒或噬菌体载体并导入宿主中繁殖——利用各种筛选方法来筛选目的基因，如表型筛选法、杂交筛选、PCR筛选和免疫筛选。描述原核生物基因表达的基本元件：答：(1)启动子：DNA序列中被RNA聚合酶、转录调节因子等识别并结合形成转录起始复合物的区域。Sextama box: 也称-35序列，识别序列。其中心位于起始点上游大约35bp处。其共有序列为TTGACA.是RNA聚合酶的识别位点(R site)； Pribnow box: 也称-10序列，在起始点的上游，其共有序列为TATAAT，是RNA聚合酶的紧密结合位点(B site)，在Pribnow框内DNA的双螺旋解链17个核苷酸左右，与RNA聚合酶形成所谓开放性启动子复合物，从而使RNA聚合酶定向，行使其转录功能；转录起点为+1位点(I site)；这三个位点定义为核心启动子。核心启动子上游的-70～-40区域含有与CAP-cAMP复合物结合，激活转录的正控制位点，即上游控制因子(USE)。核心启动子与上游控制因子一起被统称为扩展的启动子。(2)终止子：一个或多个发夹结构，连续的6个U是RNA聚合酶从模板上解离下来的信号。根据体外试验中转录终止是否需要特定辅助因子Rho(ρ)的参与，又分为两种：不依赖ρ因子的终止子和依赖ρ因子的终止子。(3)SD序列：位于mRNA 5’端，被核糖体识别并结合的较为保守的核苷酸序列，在原核生物中该位点称为SD序列，位于起始密码上游3～10bp的位置，同16S rRNA 3’端的序列互补。(4)起始密码子：AUG；(5)终止密码子：UAG ,UAA ,UGA；(6)调节基因：位于启动子的上游，编码调节蛋白，阻遏蛋白与操纵基因结合阻止基因表达，诱导蛋白结合在启动子区域，加强基因的表达。(8)操纵基因：与阻遏蛋白结合，终止转录。试述限制性内切酶的作用特点：命名和写法也需要掌握。答：根据酶的组成、识别和切割的位点及是否需要辅助因子可将限制性内切酶分为三类：Ⅱ类限制性内切酶占内切酶的绝大部分，由修饰酶和切割酶组成，识别回文对称序列，在回文序列内部或附近切割DNA双链，产生3′-OH和5′-P基团的DNA产物，反应需Mg2+，不需ATP。不同限制性内切酶识别和切割的特异性不同，结果有3种情况：1.产生3′突出粘性末端。2.产生5′突出粘性末端，3.产生平末端，另外，有些限制性内切酶还具有星星活性，即在极端的条件下，如高PH值和低离子强度下，限制性内切酶可以切割类似但不同于其特定识别序列的序列。最常见的一类活性改变是允许碱基替代和识别序列中碱基的缺失。试述利用Dpn I进行定点诱变的原理和方法：答：限制