甘薯海藻糖-6-磷酸合成酶的克隆及原核表达.docxVIP

甘薯海藻糖-6-磷酸合成酶基因的克隆和原核表达鞠俊 0942043010合作者：张凯歌 严川强 向凌霄 夏雨晴 赵雨佳摘要：海藻糖-6-磷酸合成酶是海藻糖合成途径的关键酶，在植物对逆境的适应过程起重要的作用。之前在细菌和酵母中，这种酶被克隆，并且进行了一些功能研究，而在植物中，这种酶的研究还很少。此次，我们以甘薯为模型，成功构建了甘薯的海藻糖-6-磷酸合成酶的原核表达载体。未来，我们将通过测序，得到氨基酸序列，并与其它物种进行同源性分析，构建这种酶的进化图谱。简介：海藻糖是由两个葡萄糖残基经过α,α-1,1 糖苷键连接而成的非还原性二糖，大量实验表明海藻糖不仅可以作为碳水化合物储藏能力，而且具有在寒冷，干燥和高渗透压下保护生物膜和蛋白质结构的功能。还可以保护DNA 免受放射性的损伤。海藻糖的合成过程大致分为两个过程，一是UDP-葡萄糖为底物合成6-磷酸葡萄糖，然后6-磷酸葡萄糖去磷酸化生成海藻糖。第二步涉及一个关键酶，就是海藻糖-6-磷酸合成酶。此次，我们以甘薯为模型，研究这种酶的抗逆功能。1．材料1.1 薯材、菌株、质粒甘薯（Ipomoea batatas Lam）品种为徐薯18（本实验室品种），E.coli BL21(DE3)，E.coli JM109 原核表达载体使用pET32a（+）（本实验室保存）。1.2 主要试剂和工具酶RNA提取试剂盒购自Invitrogen，胶回收试剂盒购自Axgen公司，M-MLV逆转录酶购自Invitrogen，RNase inhibitor购自Fermentas，KOD-Plus-Neo酶购自日本东洋纺公司，引物由Invitrogen 以及华大基因公司合成，测序由华大基因公司进行。2.方法2.1甘薯叶片RNA提取：用Trizol试剂法提取甘薯叶片总RNA2.2 第一链cDNA 的合成及模板的验证。以之前所提的RNA为模板, 设计加接头的oligod(T)[5′- GCTGTCAACGATACGCTACGTACGGCATGACAGTG(T) 18 -3′]作引物, 用反转录试剂盒合成cDNA 第一链,然后直接用反转录产物进行β-actin基因的扩增上游引物5-TTCCCCGGTATTGCGGATAGAATG-3下游引物 5-CGGACCGGACTCATCATACTCTG -3’PCR 的反应条件：94度预变性2min，98度10sec，54度30sec，68度3min，30个循环，68度延伸6min。1%的琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物。2.3 甘薯海藻糖-6-磷酸合成酶的扩增以第一链cDNA 为模板，TPS-F 和TPS-R 为引物，使用KOD-Plus-Neo（1U/ul）高保真酶进行PCR。TPS-F： 5-GAAAACCTGTACTTCCAGGGTATGATGTCCAAATCGTATACCAAC -3TPS-R 5-GTTTAGAGGCCCCAAGGGGTTAATAGGGATTGAGCACGAGGGG -3PCR反应条件：94度预变性2min，98度10sec，54度30sec，68度3min，30个循环，68度延伸6min，然后1%琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，并进行胶回收纯化2.4质粒pET-32的扩增以pET-32质粒为模板，pET-F和pET-R为引物，使用KOD-Plus-Neo (1U/ul)高保真酶进行PCR。pET-F5-GGGAGCACGAGTTAGGGATATAACCCCTTGGGGCCTCTAAAC- 3pET-R5’-ACCCTGGAAGTACAGGTTTTCACCAGAAGAATGATGATGATGATGG-3’PCR 的反应条件:94度预变性2min，98度10sec，60度30sec，68度3min，30个循环，68度延伸8min，然后1%琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，并进行胶回收纯化。2.5 SLIC法构建原核表达质粒Rcas基因和质粒载体通过T4 DNA聚合酶处理、退火，构建得到重组质粒，2.6 重组质粒转化感受态大肠杆菌后，挑取阳性克隆进行液体培养，并用碱裂解法提取质粒。将重组质粒酶切后，进行凝胶电泳，验证重组质粒的正确性。2.7 Rcas蛋白的诱导表达将经过测序的TPS基因与pET-32a (+)的重组子转化E. coli BL21 (DE3)菌株，使用LB（ 50 μg/ml Amp）平板进行筛选，37℃培养至OD600 of 0.5时，加入 IPTG，IPTG最终浓度梯度为：0.1mM、0.5mM、1mM、2mM。于18℃进行16h诱导表达。1ml菌液加入100μL的SDS上样缓冲液，100℃煮沸5min，取30μL上样样品点样，分析SDS胶，观察表达结果3.结果与分析：3.1甘薯叶片总RNA 提取RNA的条带很多，说明大部分的mRN