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生物化学与分子生物学实验技术 复习题 一、名词解释 1、DNA重组技术：（recombinant DNA technology)按照人的意愿，在体外对DNA分子进行重组，再将重组分子导入受体细胞，使其在细 胞中扩增和繁殖，以获得该DNA分子的大量拷贝，表达相关基因的产物，是进行基因功能研究的基本方法。 2、杂种核酸分子：由来自不同物种的生物体单链DNA复性所形成的双链DNA分子，称为杂种核酸分子。能够形成杂种核酸分子的DNA分子，其亲缘关系较为密切。DNA印迹：DNA印迹是一种将电泳分离的DNA片段转移到固相支持物上用探针与靶DNA进行杂交的技术，又称Southem杂交。指某一受体细菌通过直接吸收来自另一供体细菌的含有特定基因的脱氧核糖核酸（DNA）片段，从而获得了供体细菌的相应遗传性状，这种现象称为细菌转化。 SNP： 8、原位杂交：用标记的核酸探针，经放射自显影或非放射检测体系，在组织、细胞、间期核及染色体上对核酸进行定位和相对定量研究的一种手段。 9、RNA原位杂交：用放射性或非放射性标记的特异性探针与被固定的组织切片反应，若细胞中存在与探针互补的mRNA分子，两者杂交产生双链RNA，就可通过检测放射性标记或经酶促免疫显色，对该基因的表达产物在细胞水平上做出定性定量分析。 10、染色体原位杂交：指用同位素或非同位素标记互补的核酸为探针，使之与染色体DNA直接结合，经过放射自显影或免疫反应，在染色体上显示特异的DNA序列，是基因定位的一种重要方法。 11、RNA干扰：RNA干扰现象是一种进化上保守的抵御转基因或外来病毒侵犯的防御机制，是指内源性或外源性与靶基因的转录产物mRNA存在同源互补序列的双链RNA，在细胞内特意地降解该mRNA，从而致使特异性的基因有效封闭的过程，是一种序列特异性的转录后基因沉默。 12、DNA芯片：又称基因芯片、DNA阵列，是指在固相支持物上原位合成寡核苷酸或者直接将大量的DNA探针以显微打印的方式有序地固化于支持物表面，然后与标记的样品杂交，通过对杂交信号的检测分析，可得出样品的遗传信息（基因序列及表达的信息）。由于常用计算机硅芯片作为固相支持无，所以称为DNA芯片。 二、简答 1、试说明Southern杂交的原理及主要操作。 其基本原理是：具有一定同源性的两条核酸单链在一定的条件下，可按碱基互补的原 则形成双链，此杂交过程是高度特异的。Southern杂交可用来检测经限制性内切酶切割后的DNA片段中是否存在与探针同源的序列,它包括下列步骤:　　(1) 酶切DNA, 凝胶电泳分离各酶切片段,然后使DNA原位变性。 　　(2) 将DNA片段转移到固体支持物(硝酸纤维素滤膜或尼龙膜)上。 　　(3) 预杂交滤膜,掩盖滤膜上非特异性位点。 　　(4) 让探针与同源DNA片段杂交,然后漂洗除去非特异性结合的探针。 　　(5) 通过显影检查目的DNA所在的位置。Sanger双脱氧链终止法测序的原理及操作。 原理：以单链DNA为模板，使用特异引物在DNA聚合酶作用下进行延伸反应时，若在反应物中加入一定量的2’，3’—双脱氧三磷酸腺苷酸(ddATP)，则在正在增长的DNA链中应当掺入dATP的位置上掺入了ddATP；由于ddATP在脱氧核糖的3’位置上缺少一个经基，不能同后续的dNTP形成磷酸二酯键，因此，正在增长的DNA链不可能继续延伸而终止。这样链延伸将与随机发生但却十分特异的链终止展开竞争，而反应产物则是一系列以ddATP结尾的长短不一的寡核苷酸。如果在4组独立的酶反应中分别采用4种不同的ddNTP，结果将产生4组寡核苷酸混合物，它们将分别终止于模板链的每一个A、每一个C、每一个G或每一个T的位置上。将反应物变性，在可以区分长度仅差一个核苷酸的不同DNA分子的条件下，对各组寡核苷酸进行凝胶电泳分析，只要把几组寡核苷酸加样于测序凝胶中若干个相邻的泳道之上，即可从凝胶的放射自显影片上直接读出DNA上的核苷酸顺序。 操作：主要包括以下几个步骤 制备标记片段：为便于分析，Sanger双脱氧链终止法合成的DNA片段必须标记，通常是预先将反应体系中的引物5’端用放射性同位素或荧光素标记。 电泳：将四个反应体系中获得的DNA片段在同一块凝胶上走变性电泳，可以按长度分离，形成阶梯状排列的区带。 显影：将凝胶电泳区带显影，获得DNA图谱，用于读序。同位素标记DNA片段要用放射自显影，荧光标记DNA片段可用激光扫描。 读序：从DNA图谱上读出DNA的碱基序列。从凝胶底部到顶部读出的序列为新生链5’→3’方向的碱基序列。新生链的碱基序列是待测序DNA的互补序列。 3、简述建立cDNA文库的主要步骤。 构建 cDNA 文库通常包括：总RNA 的提取，mRNA 的分离及其