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紫外可见分光光度法测定维生素B2
上海大学生命科学实验中心 实 验 报 告 课 程： 生化分析实验 姓 名： 吴梦楠 日 期： 2011.09.21 学 号：同组者： 指导老师： 戴小峰 实验时间： 2011.09.19 温 度： 湿 度： 实 验 名 称：紫外可见分光光度法测定维生素B2
实 验 目 的：1、维生素B2的紫外可见光谱图的测绘
根据E1%1CM444nm文献值323求取样品中VB2的含量
用标准曲线法求取样品中VB2的含量
比较两种方法的误差来源
实 验 原 理：维生素B2，通常指核黄素。维生素B2在224、267、375、444nm处具有吸收峰。一 般取444nm的波峰为定量吸收峰，除了用一般的工作曲线法外，还可按C17H20N4O6 的吸收系数（E1%1CM444nm）为323计算，求取样品中维生素B2的含量。
实 验 器 材：Cary100UV-Vis分光光度计、冰醋酸（AR）、氢氧化钠1mol/L（AR）、维生素B2标 准试剂（0.3mg/ml）、药片（含维生素B2片）。
实 验 步 骤：1、取待测片剂20 片，精密称定、研细，精密称取适量（约相当于维生素B210mg）， 置于1000ml容量瓶中，加冰醋酸5ml与水100ml，置水浴（100℃）加热1小时，时 时摇振，使维生素B2溶解，加水稀释，冷却后加氢氧化钠液（1mol/L）30ml。用水 稀释至刻度，摇匀，过滤；弃去初滤液，取续滤液，在444nm波长处测定吸收度， C17H20N4O6的吸收系数（E1%1CM444nm）为323计算。
用移液管分别吸取2ml、4ml、5ml、6ml、8ml维生素B2标准试剂（0.3mg/ml） 于5个100ml容量瓶中，加水定容至刻度，摇匀。用紫外分光光度计分别测量5个 容量瓶中的VB2稀释液，得到5个吸收度数值A444nm。以VB2稀释液浓度为横坐标， A444nm数值为纵坐标，建立VB2浓度与吸收度的标准曲线，然后测出待测液的吸收度 数值，在标准曲线上找到相应的浓度数值即可。
实 验 结 果：1、维生素B2的紫外可见光谱扫描图
维生素B2标准工作曲线图
标准液体积（ml） 0 2 4 5 6 8 待测液 标准液浓度（μg/ml） 0 6 12 15 18 24 A444nm 0 0.189 0.373 0.487 0.561 0.755 0.322
根据工作曲线，计算得：待测液浓度为10.222μg/ml
思考题：1、本方法要求在避光下进行，试述理由。
答：本方法测定的是物质在特定波长下光的吸收，避免VB2遇光分解干扰数据测定。
当吸收值为何值时，浓度测量的相对误差最小。
答：当吸光值为0.2——0.8之间，相对误差最小。
如何选择参比溶液？基本原则是什么？
答：当试剂与显色液为无色，选择水，当试剂有色，显色液无色，选择不如显色液的被测液，当显色剂有色时，可选择不加试样溶液的试剂。原则是消除本身物质以外的影响因素。
4、比较两种定量方法，探求误差原因。
答：标准曲线：每次的色谱条件难以完全相同，有误差。
文献曲线：因操作、环境、仪器、人员与文献值不同，引起误差。
本实验中一般选取445nm左右的波峰为维生素B2的定量吸收峰，为什么？
答：可减少其他物质的干扰，且波峰较宽有利于检测。
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