细胞凋亡DNALadder检测试剂盒.PDFVIP

细胞凋亡DNA Ladder 检测试剂盒 Cell Apotosis DNA Ladder Detection Kit 说明书修订日期：2015.10.07 Cat number：KGA111-KGA113 Store at -20℃ for 12 months For Research Use Only 一、试剂盒说明 细胞核染色质 DNA 断裂是细胞凋亡的标志特征。在细胞发生凋亡时，核酸内切酶被激活，选择性降解 染色质DNA，形成50-300 kb 的大片段，并进而在核小体连接处断裂，形成180-200 bp 或其整倍数的DNA 片段，这些 DNA 片段可从细胞中提取出来，通过琼脂糖凝胶电泳，溴化乙啶染色呈现为梯状条带（DNA Ladder），并据此判断细胞凋亡产生。凯基细胞凋亡DNA Ladder 检测试剂盒提供了一种简便、快速地提取 染色质DNA 的方法，并增加对小片段DNA 的回收，从而增强了检测的敏感性。 本试剂盒可应用于培养细胞凋亡检测（不推荐用于检测组织样本）。 二、试剂盒组份 Cat:KGA111 Cat:KGA112 Cat:KGA113 储存条件 组份 20 assays 50 assays 100 assays Lysis Buffer 1.0 ml 2.5 ml 5.0 ml 4℃ Enzyme A 100 μl 0.25 ml 0.5 ml -20℃ Enzyme B 100 μl 0.25 ml 0.5 ml -20℃ 醋酸氨溶液 800 μl 2.0 ml 4.0 ml 4℃ Loading Buffer 100 μl 0.3 ml 0.5 ml 4℃ 三、试剂盒以外自备仪器和试剂 高速离心机、微量移液器、涡旋振荡器、凝胶电泳仪、37-55℃水浴锅 冰乙醇、1.5m L Microtube 、PBS、胰酶消化液、TE Buffer ，琼脂糖，TBE、溴化乙啶、DNA Ladder Marker 四、使用注意事项 1. DNA Ladder 出现在细胞凋亡晚期，观察细胞形态已发生皱缩出芽，染色质完全凝聚，细胞核已固缩断 裂的凋亡晚期形态，建议该种形态的凋亡细胞比例在30% 以上时进行DNA Ladder 检测或先进行Tunel 检测. 2. DNA Ladder 出现在一个较短的时间段，在凋亡早期取样，则无DNA 降解的条带，而在凋亡末期取样 则产生与细胞坏死相似的DNA 弥散条芾。因此取样时间需根椐不同种类的细胞和诱导剂而摸索确定。 3. 贴壁细胞最好不用胰酶消化而用细胞刮收集。 4. 某些细胞不产生这种核小体间的DNA 断裂，而是产生50-300kb 的大片段断裂。 五、操作方法 5 1. 收集5*10 细胞（2000r/min ，4 度，离心5min ）于1.5mL 微量离心管中；（注意：不要使用过多的细 胞，否则，随后的酶解可能不完全，会形成很粘稠的DNA 溶液。） 2. 用PBS 洗涤细胞二次（2000r/min ，4 度，离心5min ），弃上清； 3. 沉淀的细胞中每管加入50μL Lysis Buffer，用移液管尖混匀细胞沉淀。（注意：不要形成强烈的涡旋， 否则，高分子量DNA 可能会被剪切。以剪过的枪头插入液面下，打入空气轻轻吹动液体混匀。） 4. 再每管加入5μL Enzyme A 溶液，轻弹管尖混匀，不要形成涡旋，37 度孵育10-20min； 5. 在上述溶液中每管加入5μL Enzyme B 溶液，轻弹管尖混匀后，50 度孵育30min 或至溶液澄清为止； 6. 加入40μL 醋酸氨和200μL 冰乙醇 （99%-100%）, 混匀，置于-20℃，静置20-30min ； 7. 4℃，12000-14000 rpm 离心10min，小心地弃去上清，收集沉淀的DNA