第十三单元 综合性实验课件.pptVIP

第十三单元 （综合型实验） ;实验一 酶联免疫吸附实验检测 伤寒O抗体方法的建立 （综合性实验）;实验原理 ;; 制备抗伤寒O抗体和O抗原 ;; 取伤寒沙门菌O901接种于普通琼脂平板，37℃　培养24h，用无菌生理盐水洗下菌苔，配成70~100亿/ml菌悬液，隔水煮沸2h，离心，3500r/min，10min，取上清即伤寒沙门菌可溶性菌体“O”抗原。 ; 抗体制备 ; 1份免疫血清加1份生理盐水，边搅拌边滴加2份饱和硫酸铵溶液，于4℃静置2h，2000r/min离心20 min，吸弃上清，将沉淀溶于适量生理盐水（尽量保持高蛋白浓度），放置透析袋中，多次更换生理盐水(透析液)，得初步纯化的免疫抗体。采用改良NaIO4标记法将酶与抗体的连接，其他备选的标记方法请参考单元一。;取5 mg HRP溶于0.5 ml双馏水中，加入新配制的0.06 M NaIO4水溶液0.5 ml，混匀，4 ℃ 30 min； 再加入0.16 M乙二醇水溶液（10 ml H2O+0.09 ml乙二醇）0.5 ml，室温放置30 min。 然后加入含5 mg纯化抗体的水溶液1 ml，混匀，并装入透析袋，于0.05 M pH 9.5碳酸盐缓冲液中搅拌透析6 h（或过夜），使之结合； 加入NaBH4溶液（5 mg/ml）0.2 ml，混匀，4 ℃ 2 h； 最后缓慢加入等体积的饱和硫酸铵溶液，混匀，4 ℃ 30 min，离心，去上清，以0.02 M pH 7.4 PBS液溶解沉淀并4 ℃透析除盐过夜； 次日取出离心，去除沉淀，即得酶-抗体（HRP-IgG）结合物，以0.02 M pH 7.4 PBS液加至5 ml。 ;①将酶标抗体用稀释液做系列稀释，加入包被有伤寒抗原的酶标板中（50μl/孔），37℃ 30min。 ②洗涤液充分洗涤3次，甩干。 ③各孔内加底物液0.1ml，置暗处20 min。 ④各孔内加入终止液终止反应。 ⑤用酶标仪检测OD值。 以OD值在0.８左右的最小稀释倍数为待检样本的最佳稀释倍数。;①从5倍开始用酶标稀释液进行系列倍比稀释（连续稀释10个管），与确定工作浓度的酶标抗体一同加入包被有伤寒抗原的酶标板中，另在2孔中加入稀释液作空白对照，置37℃恒温箱30 min。 ②取出用洗涤液充分洗涤3次，甩干。 ③各孔内加底物液0.1ml，置暗处20 min。 ④各孔内加入终止液终止反应。 ⑤用酶标仪检测OD值。 空白对照OD值在0.8左右实验成立，以标本OD值在0.8～0.05的稀释度（抗体单位）作为标准品的工作范围，根据对标准抗体血清所测得的OD值，在方格纸上以OD值为x轴，抗体单位为Y轴绘制标准曲线。; 按预试验摸索的实验条件进行测定： ①将标准血清进行系列倍比稀释（连续稀释10个管）。 ②将待检血清用酶标稀释液适当稀释。 ③稀释液作空白对照。 ④将稀释的酶标抗体（50μl/孔），同待检标本、不同单位的标准血清和空白对照标本一同加入包被有伤寒抗原的酶标板中（50μl/孔）。 ⑤置37℃恒温箱30 min。 ⑥加底物，终止反应后检测OD值。; 阳性标本反应孔不显色，空白标本反应孔显色说明实验成立。根据对标准抗体血清所测得的OD值和其所对应的抗体单位标绘制准曲线或建立的回归方程，根据绘制的准曲线求出每个标本的抗体单位。;;实验二 机体免疫功能评估 （综合性实验）;无胸腺的裸鼠是T细胞选择性缺陷的天然动物模型;人的重症联合型免疫缺陷综合征;实验原理 ;; 基础免疫 ;;将做过基础免疫的小鼠随机分成两组（造模组和实验对照组）；另取数量相等的未经免疫的小鼠为空白对照组。 造模组小鼠可采用以下方法之一诱导免疫抑制,也2方法均用,进行对比。 方法一: 每鼠腹腔注射环磷酰胺50mg/kg（参考剂量），连续5天后免疫功能显著降低。 方法二：每鼠每天腹腔注射氢化可的松50mg/kg（参考剂量），5天后免疫功能显著受抑。; 致敏后第7天，将１％DNFB溶液10μl均匀涂抹于小鼠右耳（两面）进行攻击，空白对照组同样涂耳但未致敏。攻击后24 h，剪下左右耳壳，取同样大小的耳片，称重。; 优化间接法检测小鼠抗卵核抗原的条件 ①将待检血清从5倍开始用酶标稀释液进行系列倍比稀释（连续稀释10个管），分别加入已用抗原包被好的酶标板中（每孔加0.1ml），置37℃恒温箱30 min。 ②取出用洗涤液充分洗涤3次，甩干。 ③各孔加酶标抗体0.1ml，置37℃恒温箱30 min。 ④取出用洗涤液充分洗涤3次，甩干。 ⑤各孔内加底物液0.1ml，置暗处20 min。 ⑥各孔内加入终止液终止反应。 ⑦用酶标仪检测OD值。