第三章 层析概况课件.pptVIP

做纯化似拂轻尘,制填料如煮小鲜 ;层析法或称色谱法（chromatography）是一种物理或物理化学的分离分析方法。;层析方法的分类：;薄层层析：;一、常用术语：;6、外水体积（Vo）：是基质颗粒之间的体积总和。 7、内水体积（Vi）：是基质颗粒内部的体积总和。 8、基质体积（Vg）：是基质自身所具有的体积。 Vo、 Vi、 Vg都是随着床体积和基质性质变化而变化的。 9、床体积（Vt）：通常床体积是指膨胀后的基质在层析柱中所占有的体积（Vt）。 Vt是基质的外水体积Vo和内水体积Vi以及自身体积Vg的总合。 Vt= Vo + Vi + Vg 10、洗脱体积（Ve） ：是指某一组分从柱顶部到底部的洗脱液中出现浓度达到最大值时的流动相体积。 11、分配系数和迁移率：分配系数是指一组分在固定相与流动相中含量的比值，常用K表示。而迁移率是指一组分在相同时间内，在固定相移动的距离与流动相移动距离之比值，常用Rf表示。 K值越大，表明该组分与固定相的亲和力大，迁移率小。 K值可以作为定性参数。;二、基本原理;混合组分的分离过程及检测器对各组份在不同阶段的响应 ;三、色谱参数;2、基线 （base line）：检测器中只有流动相通过或虽有样品的浓度变化而不能被检测器所检出时，所给出的流出曲线称为基线。 正常基线：基线的高低反映检测器的本底高低，基线主要由流动相中所含的杂质等因素决定。 噪音（noise；RN）：各种未知的偶然因素引起的基线起伏的现象称为噪音。噪音的大小用噪音带的宽度来衡量。 漂移（drift；d）：极限随时间朝某一方向的缓慢变化，称为漂移。主要由实验条件不稳定引起的。 3、色谱峰（peak）或色谱带（band）：色谱流出曲线上突起的部分称为色谱峰。 正常的色谱峰为对称形正态分布曲线，曲线有最高点，以此点的横坐标为中心，曲线对称地向两侧快速单调下降。 不正常的色谱峰：拖尾峰及前延峰。 对称因子（fs）：正常峰和不正常峰可用对称因子来衡量， fs=（B+A）/2A 峰高（或峰面积）：用于定量； 峰位：用于定性； 峰宽：用于衡量柱效。 ;（二）定性参数;（三）柱效参数;理论塔板数（n）：是衡量柱效的指标。理论塔板数取决于固定相种类、性质（粒度、粒度分布等），填充（或涂布）状况、柱长（或板长），流动相的流速及测定柱效（或板效）所用物质有关。在液相色谱法中还与流动相的种类性质有关。 n=(tR/δ )2; δ=1/2.355×W1/2 n=5.54(tR/W1/2 )2;范德姆特方程;（四）分离参数;R 越大，相邻组分分离越好。当R=1.5 时，分离程度可达99.7%，因此R=1.5 通常用作是否分开的判据。 ;2、色谱分离方程 R 的定义并未反映影响分离度的各种因素。也就是说，R未与影响其大小的因素：柱效n、选择因子?和保留因子k联系起来。 ;五、层析柱的制备与层析操作;1、填料的选择：要分离物质的性质 2、层析柱的选择： 直径与柱长的比例：1:10-1:40 层析柱的床体积是由要处理样品的量来决定的。 3、填料的用量：一般为待分离样品的30-50倍。 4、装柱：装填均匀，松紧一致，没有气泡。 5、上样和洗脱： 上样液体积小于床体积的1/2，体积越小越有助于分离效果。 洗脱液的流速要恰当控制 6、填料的再生：不同基质的再生方法不同。;第二节、薄层层析;操作及注意事项： 1、薄层板的制备 2、点样 3、展层： 选择适当的??层剂 使用恰当的展层装置 4、显色; 聚酰胺薄膜层析对极性物质的吸附作用是由于它能和被分离物之间形成氢键。层析时，展层剂与被分离物在聚酰胺薄膜表面发生吸附、解吸附、再吸附和再解吸附的连续过程，达到分离目的。