山地麻蜥Sox与Dmrt基因保守区的克隆研究和其睾丸组织cDNA文库的初步构建.pdf

山地麻蜥Sox 与Dmrt 基因保守区的克隆研究 及其睾丸组织 cDNA 文库的初步构建 摘 要 Sox 与 Dmrt 基因家族是参与生物个体发育的两个基因家族，在进化上高 度保守。Sox 家族成员的典型特征是编码的蛋白质都具有一个保守的基序 HMG-box,可以与 DNA 序列 (5’-(A/T)(A/T)CAA(A/T)G-3’) 特异性结合, 促进 基因的特异转录, 从而在胚胎发育及性别分化中起着重要的调控作用；而 Dmrt 基因家族是一个与性别决定相关的基因家族，该家族成员都含有一个具有DNA 结合能力的保守基序―DM 结构域，以锌指结构与特异 DNA 序列结合，在性 别决定和分化发育的调控中担负着重要的功能。 为了研究山地麻蜥 (Eremias breuchleyi) 的Sox 基因和 Dmrt 基因，本文采 用简并 PCR 技术，分别对山地麻蜥 Sox 基因的保守序列和 Dmrt 基因的 DM 结 构域进行了扩增、克隆和序列分析。经 SSCP 技术筛选，结果在山地麻蜥的雌 雄个体中筛选出 7 个 Sox 基因家族成员，且无性别差异，与 GenBank 联机分析， 发现其与人类相应SOX 蛋白氨基酸序列的一致性分别为96%，88%，94%，99%， 96%，98%，97%，按通用命名法，根据山地麻蜥的拉丁名Eremias breuchleyi ， 分别命名为 EbSox2 ，EbSox3 ，EbSox4 ，EbSox11 ，EbSox12 ，EbSox14 ，EbSox21 ； 同样，通过 SSCP 技术筛选和测序，得到了 5 个具有不同 DM 序列的 Dmrt 基 因克隆，分别命名为EbDmrt1a ，EbDmrt1b ，EbDmrt3 ，EbDmrt4 ，EbDmrt5 。 本研究结果显示，在山地麻蜥基因组中存在着 Sox 和 Dmrt 基因家族的多个成 员，与其他动物相关的 Sox 和 Dmrt 基因进行聚类分析，显示这两个基因家族 在动物系统进化上具有高度的保守性。 为了进一步探索山地麻蜥的性别决定分子机制，获得相关基因的全长 cDNA 序列，本研究运用 SMART (switching mechanism at 5’ end of RNA transcript) 技术，初步构建了山地麻蜥睾丸组织 cDNA 文库。琼脂糖凝胶电泳 结果表明，文库所含全长 cDNA 的长度主要集中在 500~2000bp 之间，说明该 文库符合建库的要求；将双链 cDNA 通过 T/A 克隆、随机挑选阳性克隆并测序 后，得到一条 592bp 的全长cDNA 序列，该基因全长 cDNA 序列中有 162bp (编 码 53 个氨基酸) 的 ORF (open reading frame)，5’端非翻译区 158bp，3’端非翻 译区 272bp ，另外在 cDNA 540bp 处有一个加 Ploy (A) 的信号序列。该文库为 进一步构建高质量的 cDNA 文库，筛选、克隆性别决定基因全长 cDNA 序列奠 定了基础。 关键词：山地麻蜥，Sox 基因，Dmrt 基因，睾丸组织，cDNA 文库 Studies on the Sox and Dmrt genes and Initial Construction of cDNA Library of Testis in Eremias breuchleyi Abstract Sox and Dmrt gene families participate in the development process of animal. The Sox genes form a large family which is characterized by a highly conserved DNA-binding and share a high sequence similarity with the HMG box region of the human Y chromosomal gene, SRY. They play important roles in embryonic