纤维素酶产生菌分离.pptVIP

纤维素酶产生菌的分离 一、?实验目的 ? 1、初步掌握菌种筛选方法的设计。 ?2、学习并掌握纤维素酶产生菌的分离技术。 3、学习用3,5-二硝基水杨酸法测定还原糖的方法测定酶活。 二、实验原理 ?在含有纤维素的培养基中加入刚果红时，刚果红能与培养基中的纤维素形成红色复合物。当纤维素被纤维素酶分解后，就无法形成刚果红-纤维素复合物，培养基中就会出现透明现象。根据透明圈的大小从而可以筛选活性高的纤维素分解菌。 纤维素酶水解纤维素，产生纤维二糖、葡萄糖等还原糖，能将3,5-二硝基水杨酸中硝基还原成橙黄色的氨基化合物，利用比色法测定其还原物生成量来表示酶的活力。 三.材料与试剂 1.取样：树根下腐烂叶较多的泥土 2.试剂? 羧甲基纤维素CMC、NaCl、MgS04·7H20、KH2P04、酵母浸粉、蛋白胨、蒸馏水、琼脂、Na2HP04、酵母膏、刚果红试剂。 3,5-二硝基水杨酸显色液， 0.5%羧甲基纤维素钠水溶液。 3.仪器 ? 小铁铲和无菌纸或袋（可省）、小烧杯、100ml量筒、滤纸、漏斗、棕色试剂瓶、1000ml三角烧瓶1个、500ml三角烧瓶1个、试管24个、高压蒸汽灭菌锅、培养皿24个、36支1mm无菌吸管、无菌玻璃涂棒12支、显微镜、无菌水。 培养基及试剂的配制 富集培养基：NaNO3 0.5g, KH2PO4 1.0g,MgSO4 0.5g,KCl 0.5g,Fe2(SO4)3微量，加水至1L.自然pH,以滤纸为唯一碳源。 初筛培养基A：羧甲基纤维素CMC?20g、NaCl5.0g、MgS04·7H20?0.2g、KH2P04?1.0g、酵母浸粉?5.0g、蛋白胨10g、蒸馏水1000mL、琼脂20g，pH自然，121℃湿热灭菌20min。? 复筛培养基B：CMC?10g、Na2HP04 1.25g、KH2P04?0.75g、MgSO4·7H2O?0.1g、蛋白胨1.25g、酵母膏O.25g、蒸馏水500mL、琼脂10g，pH自然，121℃灭菌20min。 羧甲基纤维素钠发酵培养基：（NH4)2SO4 2.0g, KH2PO4 3.0g,CaCl2 0.5g,MgSO4 0.5g,CoCl2 3.0mg, FeSO4·7H2O 7.5mg,ZnSO4·7H2O 2.0mg, MnSO4·H2O 2.5mg,CMC-Na 10g,加水至1L，自然pH. 试剂配制? 1.1％刚果红试剂：称取刚果红试剂1g于干净的小烧杯中，用量筒量取蒸馏水100ml使之溶解，过滤，贮于棕色试剂瓶中 2.?3,5-二硝基水杨酸显色液：称取10g?3,5-二硝基水杨酸，溶入蒸馏水中，加入20g分析纯氢氧化钠，200g酒石酸钾钠，加水500ml，升温溶解后，加入重蒸酚2g，无水亚硫酸钠0.5g。加热搅拌，待全溶后冷却，定容至1000ml。存于棕色瓶中，放置一周后使用。 ?3.??0.5%羧甲基纤维素钠水溶液，溶解后成胶状液，静置过夜。使用前摇匀。? 4.?标准葡萄糖溶液：称取干燥至恒重的葡萄糖100mg，溶解后定容至100ml，此溶液含葡萄糖1.00mg/ml。 四.方法步骤 富集培养：将样品置于无菌三角瓶中，加入十倍体积无菌水，打散均匀后，取5ml悬液，加入呈有50ml富集培养基的三角瓶，在28℃和150r/min下，震荡培养3—5d后，移取5ml培养液至另一呈有新鲜富集培养基的三角瓶中继续培养。 初筛的方法步骤? (1)配初筛培养基A，灭菌，倒平板。 (2)用稀释涂平板的方法分离纤维素分解菌。 ?稀释涂布平板法步骤： 用一支1ml无菌吸管吸取1ml富集培养液注入盛有9ml无菌水的试管中，吹吸三次，使充分混匀。然后再用一支1ml无菌吸管从此试管中吸取1ml注入另一盛有9ml无菌水的试管中，以此类推制成10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6各种稀释度的土壤溶液。 ?C．涂布将上述培养基的三个平板底面或培养皿盖周边分别用记号笔写上10-4、10-5、和10-6三种稀释度字样，每种培养基每稀释度标记3皿，然后用三支1ml无菌吸管分别由10-4、10-5、和10-6三管土壤稀释液中各吸取0.2ml对号放入已写好稀释度的平板中央位置，用无菌玻璃涂棒在培养基表面轻轻地涂布均匀，室温下静置5-10分钟。 ?D．将培养基平板倒置于28℃温室中培养3日。 ?E．将培养后长出的单个菌落分别挑取用平板画线法接种到培养基A的平面上，置28℃--29℃温室中培养，待菌苔长出后，观察水解圈情况，往培养皿中加入适量1%?的刚果红溶液(刚果红染色：将分离纯化的单菌落点种于初筛培养基平板上，37培养24h，然后