碱蓬亲环素基因SsCyp1cDNA的克隆、原核表达及耐盐性相关分析.pdf

摘 要 土壤盐渍化严重影响世界农业发展，成为危及人类生存的重大资源环境问 。为 寻求开发盐渍地资源、提高农业产量，一般采用生化分子技术方法从耐盐植物中克隆 耐盐基因并在其他高产的非耐盐植物中表达，使非耐盐植物能在盐胁迫环境下高产。 亲环素(Cyclophilins，CyPs)是一类广泛存在于各生命体的多基因家族，一般分布在细 胞质与各种细胞器中，具有肽脯氨酰顺反异构酶(PPIase) 活性，能够诱导脯氨酸肽键 的顺反异构化，使蛋白质正确折叠。研究表明，植物体内亲环素的酶活性与植物的抗 逆性密切相关，过量表达的亲环素基因能够明显的提高植物对高盐胁迫的抵抗力。盐 地碱蓬(Suaedasalsa)是一种典型的盐碱地指示植物。本论文以盐地碱蓬为材料，克隆 一个亲环素基因SsCYP-1，通过序列分析并在大肠杆菌中成功表达，最后在不同的盐 浓度的LB培养基中进行耐盐性分析。研究结果如下： 1、盐地碱蓬亲环素基因SsCYP-1 的克隆以及蛋白结构预测分析 通过简并引物扩增和RACE技术，克隆出碱蓬基因全长，大小为875bp，编码区 为531bp，编码176个氨基酸，分子量约为 18.8KDa，等电点为7.67，富含Gly和 Lys，其W、V)，39个亲水性氨基酸(N、C、Q、S、T、Y)。该基因编码的蛋白与金 丝小枣（Ziziphusjujuba），荠菜（Capsellarubella）等氨基酸序列同源性达到88%，二 级结构由α螺旋 （19.89%）、随机卷曲 （40.34%）、延伸链 （28.41%）和少量的β转角 （11.36%）构成；信号肽分析显示SsCYP基因所编码的蛋白无信号肽；跨膜结构分 析显示该蛋白不具备跨膜结构；疏水性分析显示该蛋白两端是亲水性的；螺旋卷曲分 析显示该蛋白形成卷曲的可能性很低；磷酸化位点分析显示该蛋白有7个磷酸化位 点。 2 SsCYP-1 、 基因异源性表达 根据获得的全长序列在编码区两端设计引物，并在引物两端引入BamHI和NotI 双酶切位点。构建原核表达载体pET-dute-1/SsCYP-1后转入大肠杆菌Transetta（DE3） 中诱导表达。通过SDS检测发现目的蛋白与预测蛋白的大小相一致，而对照 菌在相应位置没有条带。表明SsCYP-1蛋白正确表达。 3、SsCYP-1基因抗盐胁迫分析 取等体积的重组菌 (pET-dute-1/SsCYP-1)和对照菌 (pET-Duet-1)，分别接种 I NaCl 浓度分别为 1%、6%、7%、8%的40ml液体LB培养基（含0.01mMIPTG和 50mg·L-1 ampicillin）中培养，测定其OD600 值。结果表明 重组菌, (pET-dute-1/ SsCYP-1)比对照菌(pET-Duet-1)更具有明显的生长优势，推测出盐地碱蓬SsCYP-1基 因在抗盐胁迫方面具有重要作用。 关键词：盐地碱蓬，亲环素，肽脯氨酰顺反异构酶，耐盐性 II Abstract Soil salinization seriously harms the agricultural development in the world and endangersthesurvivalofhumanbeings,whichbecomesthemajorenvironmentalproblem In order to develop salty soil resources of and enhance the crop production with the application of biochemistry and molecular techniques, the salt-tolerant gene are isolated and cloned from salt-tolerant crops and transformed into other high-yield cropswith low salttolerance, making them grow healthily under the high-salt press