肠杆菌Enterobacter.sp CN1产氢代谢调控和其产氢相关基因的研究.pdf

I 万方数据 II 万方数据 摘要 随着化石能源的日益短缺和环境保护要求的逐渐提高，氢能源作为清洁、高效的可再生 能源越来越受到人们的重视。制取氢气的方法多种多样，例如物理制氢、化学制氢和生物制 氢。发酵生物制氢成为生物制氢技术的最佳选择是因为它具有产氢能力高、稳定性好、可实 现废物处理资源化等优点。然而，自然界中野生菌株产氢效率低一直是厌氧发酵产氢工业化 亟待解决的关键问题，所以应用分子生物学的手段对菌种及其代谢途径的改造就显得非常有 必要。目前通过基因工程和产氢代谢调控手段改造产氢微生物,是生物制氢领域的研究热点。 本文以高效产氢细菌肠杆菌Enterobacter .sp CN1 为主要研究对象，对其产氢代谢途径中 的相关基因进行了以下研究： 从甲酸代谢产氢途径考虑，利用基因工程和代谢工程来阻断菌株Enterobacter .sp CN1中产 氢竞争代谢从而提高产氢量。乳酸是肠杆菌Enterobacter .sp CN1厌氧发酵丙酮酸代谢产氢的主 要副产物。首先构建乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)基因敲除片段，然后通过运用噬 菌体λRed 同源重组方法，获得了乳酸脱氢酶基因缺失重组菌株。CN1△ldhA 工程菌利用葡萄糖 产氢比野生菌CN1 的产氢量增加17.3%，在利用丙酮酸钠和甘油产氢时比野生菌CN1 的产氢量 增加 18.1%和增加1.8倍。 + 从NADH途径产氢途径考虑，通过阻断NADH 的消耗，提高NADH/NAD 进而提高产氢。 通过运用同源重组方法分别构建乙醇脱氢酶 (Alcohol dehydrogenase,Adh)缺失重组菌和延胡 索酸还原酶（fumarate reductase，Frd ）缺失重组菌和NADH脱氢酶（NADH dehydrogenase,Nuo ） 缺失重组菌。相对野生菌CN1 的产氢量的变化为：CN1△adhE产氢减少41.3% ，CN1△frd 增加 12.6%，CN1△Nuo增加21.4% 。 结合甲酸代谢产氢和NADH途径产氢构建了乳酸脱氢酶基因和延胡索酸还原酶双缺失重 组菌以及乳酸脱氢酶基因和NADH脱氢酶（NADH dehydrogenase,Nuo ）双缺失重组菌。双敲 除菌在厌氧生长条件都受到一定的抑制，其中CN1△ldhA △frd 的生长被抑制程度更明显一些。 两个双敲除菌产氢量分别增加了32.5%和24.5% 。说明结合甲酸途径产氢和NADH途径产氢能 够进一步提高产氢能力。 最后对Enterobacter sp. CN1产氢相关基因的进行研究。克隆丙酮酸代谢中非常关键的丙 酮酸甲酸裂解酶及其激活酶基因和氢酶大小亚基基因并且构建了共表达载体。并对氢酶大亚 基基因进行了敲除实验，验证了氢酶大亚基在产氢过程是一种关键的酶。 III 万方数据 关键词：Enterobacter sp. CN1，生物制氢，基因敲除， NADH ，氢酶, 甲酸代谢 IV 万方数据 Abstract As a clean, efficient and renewable energy carrier, hydrogen energy draws more and more attention with the growing shortage of fossil fuels and gradu