酶联免疫吸附实验ELISA--操作规则(新手适用)教材.docVIP

酶联免疫吸附实验 ELISA －－操作规则（新手适用） 一、实验目的 酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immunosorbent assay 简称ELISA)是在免疫酶技术(immunoenzymatic techniques)的基础上发展起来的一种新型的免疫测定技术，ELISA过程包括抗原(抗体)吸附在固相载体上称为包被，加待测抗体(抗原)，再加相应酶标记抗体(抗原)，生成抗原(抗体)--待测抗体(抗原)--酶标记抗体的复合物，再与该酶的底物反应生成有色产物。借助分光光度计的光吸收计算抗体(抗原)的量。待测抗体(抗原)的定量与有色产生成正比。 二、实验原理 用于免疫酶技术的酶有很多，如过氧化物酶，碱性磷酸酯酶，β－Ｄ－半乳糖苷酶，葡萄糖氧化酶，碳酸酐酶，乙酰胆碱酯酶，6－磷酸葡萄糖脱氧酶等。常用于ELISA法的酶有辣根过氧化物酶，碱性磷酸酯酶等，其中尤以辣根过氧化物酶为多。由于酶摧化的是氧化还原反应，在呈色后须立刻测定，否则空气中的氧化作用使颜色加深，无法准确地定量。 辣根过氧化物酶（HRP）是一种糖蛋白，每个分子含有一个氯化血红素(protonhemin)区作辅基。酶的浓度和纯度常以辅基的含量表示。氯化血红素辅基的最大吸收峰是403nm，HRP酶蛋白的最大吸收峰是275nm，所以酶的浓度和纯度计算式是（已知HRP的A(1cm 403nm 1%)＝25，式中1％指