高效液相色谱基础知识(2012版).pptVIP

高效液相色谱基础知识 主讲 侯建军 一、简介 色谱学是现代分离分析的一个重要领域，也是一门新兴学科，在化学、生物学等领域发挥着越来越重要的地位。近几十年来，色谱学各分支，如气相色谱、液相色谱、薄层色谱等研究方法都得到了深入的研究，20世纪50年代创立了气相色谱法，它的出现把色谱法从分离技术提高到分离与“在线”分析的新水平，为色谱法成为现代分离-分析方法奠定了基础，1957年诞生了毛细管色谱法。20世纪60年代推出了色谱-质谱联用技术 （LC-MS），有效的弥补了色谱法定性分析特征性差的弱点，成为最重要的分离分析方法之一， LC-MS在选择性、灵敏度、分子量测定和提供结构信息方面具有明显的优势，能够同时获得可靠的定性定量结果，因而被广泛应用于药物的质量控制（杂质、副产物、降解产物等的鉴定和测定）、药物在生物体内的吸收、分布和代谢研究（包括代谢物的结构确定及定量）和临床医学研究（如蛋白异常的研究）。 LC-MS已成为新药研究必不可少的手段。20世纪70年代，高效液相色谱法崛起克服了 气相色谱法不能直接用于分析难挥发、热不稳定及高分子化合物等的弱点，大大扩大了色谱法的应用范围，把色谱法推进到一个新水平。 高效液相色谱（high performance liquid chromatography, HPLC）是一种高效、快速的分离分析技术，具有灵敏度高、选择性好的特点。HPLC具有的同时分离和分析的功能对于体内药物分析和体内内源性物质的分析及成分复杂的中药分析尤其重要。 HPLC的分离功能还广泛用于药物的纯化和制备，如用制备色谱分离 天然药物的有效成分，或制备手性药物的单一对应体。由于使用各种高灵敏度的检测器，如荧光、电化学和化学发光检测器，再结合许多衍生化技术及样品富集技术，HPLC对许多药物的最低检测限都达到了pg级或更低水平，非常适合于一些微量成分甚至痕量成分的分析。 由于色谱条件的可控制性及进样技术和在线样品处理技术的发展，HPLC分析的精密度完全能够满足医药分析实验室的要求。 HPLC一般在数分钟至数十分钟内即可完成一个样品分析，而且往往能够实现多组分的同时测 定，这一快速分析的特点使HPLC广泛应用于药物合成的各部反应的监控和临床治疗药物的监测。HPLC的柱切换技术是通过程序控制的切换阀改变流动相的流向和（或）流动相系统的技术。这一技术在医药分析中的应用越来越多，尤其在药物分析中的应用最为广泛。利用柱切换技术可以实现样品的在线净化与富集、在线衍生化、在多个色谱柱上进行分离。在复杂样品的分析方面有着巨大的潜力。 目前，高效液相色谱已成为化学、生化、医学、工、 业、农业、环保、商检和法检等学科领域中重要的分离分析技术，是分析化学家和生物化学家手中用以解决他们面临的各种实际分析和分离课题必不可少的工具之一。 液相色谱根据固定相性质可分为离子交换色谱、吸附色谱、键合相色谱和大小排阻色谱。 离子交换色谱法是流动相中的被分离离子，与作为固定相的离子交换剂上的平衡离子进行可逆交换时，它们对交换剂的基体离子亲和力的不同而达到分离的。 组分离子对交换剂基体离子亲和力越大，保留时间就越长。 吸附色谱法是当组分分子流经固定相（吸附剂，如硅胶或氧化铝）时，不同组分分子、流动相分子就要对吸附剂表面的活性中心展开竞争。这种竞争能力的大小，决定了保留值大小，即被活性中心吸附得越牢的分子，保留值越大。 键合相色谱法是将类似于气相色谱中的固定液的液体，通过化学反应键合到硅胶表面，从而形成固定相。 采用化学键合固定相的色谱法称为键合相色谱。若采用极性键合相、非极性流动相，则称为正相色谱；采用非极性键合相、极性流动相，则称为反相色谱。这种分离的保留值大小，主要决定于组分分子与键合固定液分子间作用力的大小。 大小排阻色谱法的固定相是一类孔径大小有一定范围的多孔材料。被分离的分子大小不同，它们扩散渗入多孔材料的容易程度不同。小分子最易扩散进入细孔中，保留时间最长；大分子完全排斥在孔外，随流动 相很快流出，保留时间最短。 在以上四种分离方式中，反相键合相色谱应用最广，因为它采用醇—水或腈—水体系作流动相。纯水易得廉价，它的紫外吸收极小。在纯水中添加各种物质可改变流动相选择性。使用最广的反相键合相是十八烷基键合相，即让十八烷基（C18H37—）键合到硅胶表面。这种键合相又称ODS （Octadecylsilyl）键合相，如国外的partisil5-ODS、Zorbax-ODS、Shim-pack CLC-ODS，国产的YWG-C18等。