阳性克隆鉴定与质粒DNA提取.ppt

实验五 阳性克隆鉴定和质粒DNA提取 ;【实验原理】 重组质粒转化大肠杆菌宿主细胞后，还需要对转化菌落进行筛选鉴定。利用α互补现象进行筛选是最常用是最常用的一种鉴定方法。现在使用的许多载体（如pUC系列）都带有一个大肠杆菌DNA的短区段，其中含有β-半乳糖苷酶基因（LacZ）的调控序列和β-半乳糖苷酶α肽链氨基端（146个氨基酸）的编码信息。这个编码区中插入了一个多克隆位点，它并不破坏读框，但可使少数几个氨基酸插入到β-半乳糖苷酶的氨基端，而不影响功能。这种载体适用于可编码β-半乳糖苷酶C端部分序列（ω片段）的宿主细胞。虽然宿主和质粒编码的片段各自都没有酶活性，但它们可以融为一体，形成具有酶学活性的蛋白质 。;这样，LacZ基因编码α肽链与失去N端的β半乳糖苷酶突变体互补，这种互补现象叫α互补。由α互补而产生的Lac＋细菌易于识别，因为它们在生色底物5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷（X-gal）存在下形成蓝色菌落，而外源DNA片段插入到质粒的多克隆位点后，几乎不可避免地导致产生无α互补能力的氨基端片段，因此带重组质粒的细菌形成白色菌落。这一简单的颜色试验大大简化了在这种质粒载体中鉴定重组体的工作。;碱法提取质粒是基于细菌染色体DNA与质粒DNA的变性与复性特征而达到分离目的的。在pH高达12.6的碱性条件下，染色体DNA的氢键断裂，双螺旋结构解开而变性。质粒DNA的大部分氢键也断裂，但超螺旋共价闭合环状的质粒DNA两条互补链不会完全分离，当以pH4.8的NaAc高盐缓冲液调节其pH至中性时，变性的质粒复性迅速而准确，而细菌染色体DNA的两条互补链彼此已完全分开，复性就不会那么迅速而准确，它们相互缠绕形成网状结构，通过离心，细菌染色体DNA与不稳定的大分子RNA、蛋白质-SDS复合物以及细菌碎片等一起沉淀下来而被除去。;【仪器与试剂】 （一）、仪器 恒温培养箱、恒温摇床、台式离心机、高压灭菌锅等。 （二）、试剂 上海生工生物工程技术服务有限公司的UNIQ-10柱式质粒小量抽提试剂盒;【实验步骤】 1、将培养好的1～2 ml细菌12,000 rpm离心15秒，去上清。 2、加100 μl Solution I，用枪头或振荡器充分悬浮细菌。 3、加入200 μl Solution II，立即上下颠倒5～10次，使细菌裂解，室温放置2分钟。 4、加入350 μl Solution III，立即上下颠倒5～10次，使之充分中和，室温放置2分钟。 5、12,000 rpm离心，5分钟。 6、将步骤5中的上清转移到套放于2.0 ml收集管内的UNIQ-10柱中，10,000 rpm室温离心15秒。;7、弃收集管中的废液，将UNIQ-10柱放入同一只收集管中，吸取500 μl Wash Solution到UNIQ-10柱，10,000 rpm室温离心30秒。 8、重复步骤7。 9、弃收集管中的废液，将UNIQ-10柱放入同一只收集管中，10,000 rpm室温离心30秒以彻底去除Wash Solution。 10、将UNIQ--10柱放入新的洁净1.5 ml 离心管中，加50 μl DW （或Elution Buffer），室温放置2分钟后，10,000 rpm室温离心1分钟。离心管中的溶液即为所抽提的质粒DNA。 ;【思考题】 1、如何提高大肠杆菌感受态细胞的效率？ 2、如何有效提高CaCl2法转化大肠杆菌的效率？