TUNEL法检测细胞凋亡成功的经验与失败的教训总结.docxVIP

 HYPERLINK /forum.php?mod=viewthreadtid=55060extra= TUNEL法检测细胞凋亡成功的经验与失败的教训总结 1. 几种细胞凋亡检测方法中TUNEL法的优点和缺点是什么？2. TUNEL法的实验原理是什么？3. TUNEL实验中几个关键步骤是什么？4. 如何减弱非特异性染色？5. 细胞通透的时间如何选择？6. 内源性过氧化物酶的封闭时间和封闭液的浓度如何确定？7. TUNEL反应混合液的孵育时间可以调整吗？8. DAB的显色时间和条件如何把握？9. 首次做TUNEL实验的注意事项？10. PBS浸洗在TUNEL法中的作用和方法分别是什么？11. 脱蜡和水化在TUNEL法中的作用和方法分别是什么？ 针对问题3（TUNEL实验中几个关键步骤是什么？）：1. 充分脱蜡和水化。脱蜡可以先60度20min，再用二甲苯两次5~10min；而水化用梯度乙醇从高浓度到低浓度浸洗，这些以便后面的结合反应充分、均匀；2. 把握好细胞通透的时间。一般根据切片的厚薄，选择蛋白酶k的孵育时间，常用10~30min，几um切片用短时间；几十um切片用长时间，通过摸索达到既不脱片，有能够使后面的酶和抗体进入胞内。3. 适当延长TUNEL反应液的时间。一般是37度1h，你也可以根据你的凋亡损伤程度，选择更长的时间，可长至2h，但要结合你最终的背景着色。4. DAB显色条件的选择。一般DAB反应10分钟左右，结合镜下控制背景颜色，最长不超过30min；我不喜欢用promega公司提供的DAB液（桃红色），不利于辨认棕褐色。5.PBS的充分清洗。我个人认为，在TUNEL反应后和酶标反应后的清洗应十分严格，可增加次数达5次，因为这些清洗直接决定最后切片的非特异性着色。6. 此外，内源性POD的封闭也十分关键。对于肝脏、肾脏等血细胞含量多的组织，我的经验是适当延长封闭时间和升高过氧化氢的浓度，可以达到很好的封闭效果，且不影响最终的特异性染色。 针对问题2（ TUNEL法的实验原理是什么？）：基本原理： 对不同组织切片先增加细胞膜通透性，然后让rTDT和bio标记的dTUTP进入细胞内，在rTDT的辅助下dTUTP与核断裂的DNA 3’-OH结合，再用HRP标记的链霉亲和素与dTUTP上的biotin结合（每个链霉亲和素至少可以再结合3个biotin分子），最后用DAB、过氧化氢与SP上的辣根过氧化物酶HRP发生氧化、环化反应，形成苯乙肼聚合物而呈现棕褐色，最终通过计数每张切片上不同视野中TUNEL阳性细胞的比例来判断细胞凋亡发生情况。 TUNEL方法检测凋亡的讨论 TUNEL方法检测凋亡的原理 ljksbs ：细胞凋亡中, 染色体DNA双链断裂或单链断裂而产生大量的粘性3-OH末端，可在脱氧核糖核苷酸末端转移酶（TdT）的作用下，将脱氧核糖核苷酸和荧光素、过氧化物酶、碱性磷酸酶或生物素形成的衍生物标记到DNA的3-末端，从而可进行凋亡细胞的检测，这类方法称为脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法（terminal -deoxynucleotidyl transferase mediated nick end labeling, TUNEL）。由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有DNA的断裂，因而没有3-OH形成，很少能够被染色。TUNEL实际上是分子生物学与形态学相结合的研究方法，对完整的单个凋亡细胞核或凋亡小体进行原位染色，能准确地反应细胞凋亡典型的生物化学和形态特征，可用于石蜡包埋组织切片、冰冻组织切片、培养的细胞和从组织中分离的细胞的细胞形态测定，并可检测出极少量的凋亡细胞，因而在细胞凋亡的研究中被广泛采用. TUNEL细胞凋亡详细流程 youngtiger： TUNEL法原位标记凋亡检测试剂盒 细胞发生凋亡以后，出现多个生物学改变特征，如：细胞膜、染色质凝集、核DNA断裂等等。目前DNA断裂检测是一种广为认可的检测凋亡的方法，这种检测可以通过提取细胞DNA进行凝胶电泳来完成，也可以进行原位检测，即常说的TUNEL（TdT介导的dUTP缺口末端标记技术）方法。 TUNEL方法的基本原理如下：在TdT酶的作用下，将生物素或者溴标记的核苷酸连接到细胞内断裂DNA游离的3OH上，然后加入酶标的链霉亲和素或者抗标记核苷酸的抗体，达到原位检测目的。 试剂盒简单操作步骤： 细胞或组织片固定（中性固定液，如3.7％甲醛） 水化（样本依次在100%、95%、70%的乙醇处理） PBS浸泡 蛋白酶K处理标本（蛋白酶K主要应用于组织样本和对照片，Cytonin用于新鲜准备的细胞样本） 双蒸水（dH2O）洗涤 3%H2O2甲醇溶液（Quenching solution）消除内源性HRP P