出血热实验室检测方法.docVIP

流行性出血热实验室检测方法 免疫学检测 用于EHF急性期病例实验室确诊、血清学核实诊断以及高危人群感染率检测的方法 附件1 IgM捕捉ELISA法（MacELISA）检测出血热IgM抗体 兰州生物制品研究所开发试剂，但无正式批号。 2.5-3小时出结果，适用于应急。 附件2 IgM捕获法胶体金标记试纸条快速检测IgM抗体 中国CDC病毒病所开发试剂，但无正式批号。 20分钟出结果，适用于应急。 附件3 免疫荧光法（IFA）检测人血清IgG抗体 浙江CDC抗原片，上海生物制品所羊抗人荧光抗体。无正式批号。 2小时出结果。 附件4 酶联免疫吸附试验（ELISA）检测血清IgG抗体 兰州生物制品研究所开发试剂，但无正式批号。 2小时出结果。 2 病毒分离 附件5 Vero E6或Vero细胞分离汉坦病毒 分子生物学 一般用于MacELISA法或胶体金标记试纸条方法核实诊断阳性的病例的 附件6 RT-PCR检测汉坦病毒基因及分型 4 血清分型 附件7 交叉保护中和实验 鼠感染率的检测 附件8 免疫荧光法检测鼠肺抗原 浙江CDC直接荧光抗体。无正式批号。 附件9 酶联免疫吸附试验（ELISA）双抗原夹心法检测血清总抗体 中国CDC病毒病所开发试剂，但无正式批号。 参考《全国肾综合征出血热监测方案》 附件1 IgM捕捉ELISA法（MacELISA）检测出血热IgM抗体 本试剂盒系采用抗人μ链捕获人血清IgM抗体，加辣根过氧化物酶－病毒抗原标记物，用以检测出血热特异性IgM抗体。具有较高的敏感性、特异性和重复性。特别适用于出血热的早期特异性诊断及其它实验性研究。本试剂盒为96人份/包装。 试验材料： （1）抗人IgM抗体（μ链）：用pH9.5的包被液包被酶标板 （2）冻干阳性血清/冻干阴性血清1支， 0.2ml/支，工作浓度为1：10； （3）冻干辣根过氧化物酶－病毒抗原标记物1支， 0.5ml/支，工作浓度为1：20； （4）冻干小牛血清1支，1ml/支； （5）浓缩洗液（10倍浓缩）1瓶，50ml；（标本稀释液为含5%小牛血清原倍洗液）； （6）A/B显色液和终止液各1瓶。 （冻干试剂先用相应量的去离子水溶解，然后临用前根据所需按工作浓度稀释使用，余下的放-20℃保存） （7）终止液：4N H2SO4 （8）酶标仪。 检测步骤： （1）将待检血清用稀释液100倍稀释，加入已包被抗人μ链抗体的酶标板一孔中，100μl/孔，同时加入已1：10稀释的阳性血清/阴性血清对照各一孔，100μl/孔，置37℃水浴孵育1小时。 （2）弃去血清，用PBS－T漂洗5遍，甩干。 （3）将冻干辣根过氧化物酶－病毒抗原标记物1：10稀释后，加入反应板相应孔内，100μl/孔，37℃水浴孵育1小时。 （4）弃去酶标抗体，用洗涤液洗涤6次，甩干。 （5）加显色液:于各反应孔内加A/B液各一滴，37℃，避光3～5分钟。 （6）加终止液（4NH2SO4）于每反应孔，一滴/孔。 结果判断： （1）目测方法： 阳性对照孔呈明显蓝色，阴性对照孔呈无色，对照成立；若待检血清孔呈明显淡蓝色或深蓝色（TMB），则标本为出血热IgM抗体阳性，反之阴性。 （2）酶联免疫检测仪检测： 于450nm（TMB）阳性对照孔OD值/阴性对照孔OD值,即P/N≥2.1，对照成立；若待检血清孔OD值与阴性对照孔OD比值≥2.1，则标本为流行性出血热IgM抗体阳性，反之阴性。 （阴性对照孔OD值小于0.05按0.05记，若大于0.05按实际数值计算） 意义： 阳性结果，表明患者新近汉坦病毒感染，用于出血热早期诊断。 附件2 IgM捕获法胶体金标记试纸条快速检测IgM抗体 适用对象： 本产品适用于人血清或血浆中出血热病毒IgM抗体的快速检测。 检测意义： 检测出血热病毒IgM抗体对于早期诊断出血热急性感染有重要指导意义。 储存条件和有效期： 室温或冰箱（4-30℃）密封保存，有效期18个月。 注意事项： 1. 仅供专业人士使用 2. 严格按照说明书操作 3. 有效期内使用，密封保存 4. 样品中的脂质、溶血及污染的的样品有可能导致错误的结果 样品收集和保存： 采取静脉血于干净未加抗凝剂（若收集血浆则加入抗凝剂）的容器内，静置使血凝固，分离血清备检测，可于4℃冰箱内保存2周；如不能及时检测可将血清置于冰箱内冷冻或冷藏。检测前复温并混匀。避免反复冻融标本。 操作步骤： 1. 如果试剂盒储存于4℃冰箱，请将所有实验用试剂与器材取出并平衡至室温 2. 打开密封的铝箔袋，取出试剂盒，平放于水平桌面上，做好标记 3. 用滴管或加样器从盛有血清或血浆的试管中取2-3滴或100(l-150(l样品滴加于测试盒上的样品孔内，于15分钟内观察测试结果