3日龄大鼠缺氧缺血性脑损伤脑组织VEGF表达变化探析.docVIP

3日龄大鼠缺氧缺血性脑损伤脑组织VEGF表达变化探析【摘要】　目的：探讨3日龄未成熟大鼠缺氧缺血性脑损伤后脑白质中VEGF的表达变化规律，研究VEGF在早产儿脑损伤发病机理中的作用，为干预治疗打下理论基础。方法：92只体重6.5~10.5 g新生3日龄SD大鼠，随机分为实验组(缺氧缺血)50只和对照组(假手术)42只，实验组死亡10只，对照组死亡2只，故进入实验的两组均为40只。实验组大鼠右侧颈总动脉结扎，术后予以低氧(6%O2+94%N2)处理4 h，以建立动物模型。对照组仅分离右侧颈总动脉，不予以结扎和缺氧处理。术后12、24、48、72 h及7 d处死8只大鼠，取脑组织，制备光镜石蜡标本。VEGF的表达采用免疫组化方法。采用全自动图像分析系统分析VEGF阳性单位表达的AU值。结果：对照组和实验组大鼠神经元、内皮细胞、软脑膜细胞、胶质细胞等均可见VEGF表达。表达变化以胼胝体和脑室周围白质部位明显。对照组VEGF的表达较弱，且随时间的增加，表达没有明显变化，组间比较差异无统计学意义(P0.05)。实验组于缺氧缺血12 h表达开始增加，缺氧缺血24 h表达达到高峰，7 d时恢复至正常，组间各时间点比较差异均有统计学意义(P0.05)。结论：未成熟大鼠缺氧缺血性脑损伤中，VEGF蛋白的表达于缺氧缺血12 h开始增加，于24 h达到高峰，7 d降至正常，说明VEGF在其发病机制中有一定作用。 【关键词】　大鼠；　缺氧缺血；　脑；　血管内皮生长因子 doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2012.20.008 随着围产医学的进步，早产儿脑损伤日益成为近年来国内外围产医学和新生儿学领域的研究热点。研究报道，早产儿这种神经系统功能障碍主要由脑白质损伤所致[1]。最近研究表明，众多细胞因子参与早产儿脑白质损伤的发病过程。血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)是近年来发现的一种细胞因子，其在早产儿脑白质损伤中的作用日益受到关注。本实验建立3日龄大鼠缺氧缺血性脑损伤模型，通过测定其后不同时间点脑白质区VEGF蛋白质的表达，探讨其在3日龄未成熟大鼠缺氧缺血后的表达变化规律，进一步阐明VEGF在早产儿脑损伤发病机理中的作用，以期为早产儿脑损伤的防治开辟新的途径，为临床的进一步研究和应用提供客观实验依据。 1　材料与方法 1.1　实验动物　92只3日龄(出生日为0天)SD(Sprague-Dawley)大鼠，雌雄不限，体重6.5~10.5 g。随机分为缺氧缺血模型组(以下简称实验组)50只和假手术组(以下简称对照组)42只，各组间雌雄、体重比较差异均无统计学意义(P0.05)。术前称重及编号，实验组动物用无水乙醚吸入麻醉，仰卧位固定于手术台上，碘伏消毒手术区，紧贴气管右侧做一约1 cm纵切口，切开皮肤及皮下组织，分离肌层，暴露右侧颈总动脉，并用9-0丝线结扎，缝合伤口，再次消毒，表皮滴少量青霉素注射液。手术于5 min内完成。术后让实验鼠于37 ℃水浴箱中恢复2 h，后置于透明密封箱内，输入含氧气6%、氮气94%的混合气体，气体流量1.5 L/min，测氧仪监测得箱内O2浓度为6%，4 h后取出，放回原饲养环境中继续母乳喂养。对照组同样分离颈总动脉，然后仅将手术线从右侧颈总动脉穿过而不予以结扎，也不予以缺氧处理。整个手术及缺氧过程中，保持周围环境温度为30 ℃以上。实验组有10只大鼠因不能耐受手术，分别在手术中和手术后死亡。对照组有2只不明原因死亡。两组大鼠共80只(实验组和对照组各40只)分别于缺氧缺血后12、24、48、72 h及7 d处死(每组各时间点8只)。 1.2　取材及切片制备 1.2.1　取材　大鼠乙醚吸入麻醉后，开胸暴露心脏，经左心室灌注肝素化0.9%生理盐水20 ml，同时在右心耳处剪一切口，至流出液体变清为止。继予以4%冰多聚甲醛30 ml灌注，至肝脏明显变白及肺脏明显水肿、四肢完全僵直后，美蓝标记前囟位置，立即开颅取脑组织，将标本于4%冰多聚甲醛固定12 h，将固定的鼠脑从前囟后以视交叉为中心前后3 mm取材，再固定24 h。 1.2.2　切片制备　标本组织块经梯度脱水、浸蜡、包埋。包埋后的组织蜡块连续切片，厚度为3 μm，每块组织取连续切片2张(1张HE染色，1张免疫组化)，分别裱于经APES处理的载玻片上，做免疫组化染色。 1.2.3　免疫组织化学染色法(SABC法)检测脑组织内VEGF的表达。 1.3　阳性结果的判定及计数方法　(1)阳性细胞的判断：VEGF显色主要在胞浆，有明确棕色或棕黄色染色为阳性细胞；iNOS显色定位于细胞浆/膜，有棕黄色染色为阳性细胞；(2)阳性细胞分级及计数方法：通过计算阳性