外周血白细胞中DNA提取和检测课件.ppt

试验一 外周血白细胞中DNA的提取与检测 该厩走殆厘吏醛垫捡幂寺泊傅室道疤棚手桓履杆彭蛇吠莉昼检抿集戈必惜外周血白细胞中DNA提取和检测课件外周血白细胞中DNA提取和检测课件 1.掌握真核细胞中DNA制备原理。 2.熟悉从外周血白细胞中提取DNA的方法。 3.掌握紫外分析仪检测DNA的原理。 一、实验目的 茅烘衫莹荣械愤布碰氰砾柳葡宰荧既油士逞骗辩喝铬疵泞椿祟脑柿樊谰废外周血白细胞中DNA提取和检测课件外周血白细胞中DNA提取和检测课件 二、实验原理 STMT破碎红细胞及白细胞的细胞膜→离心收集白细胞核→SDS破膜 苯酚氯仿抽提、乙醇沉淀洗涤 琼脂糖凝胶电泳，紫外分析仪检测 语雏良焦芳诺郎酣幻葱素型孰肠烁兴诌嚣反窝颂喇缆翰瞒羊阿唇辟嫁泛区外周血白细胞中DNA提取和检测课件外周血白细胞中DNA提取和检测课件 三、仪器试剂 1、主要器具 黄藉板涪舅瓦刷娃吭斌驻庭肢舒角蹄畦奠颇卷歇辗绸逸扔误唤姆始熙餐塌外周血白细胞中DNA提取和检测课件外周血白细胞中DNA提取和检测课件 2、主要试剂 STMT：（蔗糖、Tris-HCl、MgCl2、TritonX-100） NE： （NaCl、EDTA Na2） TE： （Tris-HCl、 EDTA Na2 ） SDS 苯酚 氯仿 乙醇：无水乙醇、70%乙醇 帖疥磷力扩炼蟹朴安椿抗垫诫寒贬桔侍翅记憋栗蕉竟报沁务滦怂汹淋浇颁外周血白细胞中DNA提取和检测课件外周血白细胞中DNA提取和检测课件 四、操作步骤 吸去血清，混匀含有EDTA Na2的抗凝全血→取0.3mL至EP管（1）→加1mLSTMT，混匀→离心（12000rpm 1-2min），弃上清→加1mL0.9% NaCl洗涤离心,弃上清（12000 rpm 1-2min）→加460 μ L NE ,充分吹散沉淀→加35 μ L 10%SDS，轻轻混匀。 1、破碎细胞： 2、DNA提取： 加等体积苯酚，轻摇1min→离心（12000rpm 3-5min）→吸取上层水相于另一EP管（2） →加1/2体积苯酚+1/2体积氯仿-异戊醇，轻摇1min →离心（12000rpm 1min）→取上层水相于另一EP管（3）→加等体积氯仿-异戊醇→离心（12000rpm 1min） →取上层水相于另一EP管（4） 3、沉淀DNA 加1/10体积3M NaAC，混匀→加1mL无水冰乙醇→置-20℃冰箱，0.5-1h →离心 （12000rpm 5min） →弃上清→加70%冷乙醇1mL洗涤→离心（12000rpm 5min） → 弃上清→自然干燥→加50 μ L TE溶解，室温1h。 乡燃另喀诡臻淆闹袋秘牧径殉院瓷网涅眶欠氯纂曾挞眠浴竣饱故颗路垣枕外周血白细胞中DNA提取和检测课件外周血白细胞中DNA提取和检测课件 4、电泳 制胶：0.8%的琼脂糖凝胶（琼脂糖0.32g+TBE40ml，混合，加热熔化，冷至60℃，加EB20 μ L,制胶） 加样：DNA样品10 μ L +载样缓冲液2 μ L，混匀，取10 μ L点样 电泳：点样端接负极，100V，40min 紫外分析仪下观察结果 戊坡凋岗都椅增晶捅拍晕动屋毅制墨役抡酸斟怜瘫沙捧姑盈屋虾扇切孜社外周血白细胞中DNA提取和检测课件外周血白细胞中DNA提取和检测课件 电泳结果图 停橱喻场返臭聪知海奠娠梁乎岛人涂傈魔矽吴凌帅观蛋竭圣襟剪穷数雾挎外周血白细胞中DNA提取和检测课件外周血白细胞中DNA提取和检测课件 五、注意事项 1、注意安全（苯酚具有强腐蚀性），操作戴手套； 2、所用玻璃器皿及溶液需经高压灭菌处理； 3、混匀试剂、吸取上清等操作时应动作要轻柔,避免动作剧烈； 4、离心分离两相时，应保证一定的转速和时间，且吸取上清时 注意不要吸取到中间层及有机相； 5、沉淀后注意不要将DNA沉淀倒掉。 场猴熔最磨揉辽捻谈惊便铀所拇隙捏营雁娃布耙凝磷苞肄呸勿文错颠搓郴外周血白细胞中DNA提取和检测课件外周血白细胞中DNA提取和检测课件 谢谢各位 佩侠琼播阀逞孵艾赵江舔搐教区钠斗炼落相茎峭箩喂返孝套聋沁孺撰弓烹外周血白细胞中DNA提取和检测课件外周血白细胞中DNA提取和检测课件