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实验一分光光度技术与蛋白含量测定课件
实验一;理论
掌握分光光度技术的基本原理
了解分光光度计的基本构造
实验
利用分光光度计进行蛋白质定量测定
1.双缩脲法测定蛋白质含量
2.考马斯亮兰结合法测定蛋白质含量
3.紫外分光光度法测定蛋白质含量 ;分光光度技术(Spectrophotography); 一、基本定义
利用物质特有的吸收光谱来鉴别物质或测定其含量的一项技术 。
应用:定性、定量
优点:灵敏度高
精确度高
操作简便、快速 ;二、工作原理
1.物质对光线有选择性吸收作用。
2.每种物质都具有其特征性的吸收光谱。
3.在一定条件下,物质对光的吸收程度与该物质
的浓度成正比。 ; 如何定性? — 利用吸收光谱鉴定化合物; 1. 朗伯(Lambert)定律
一束单色光通过一光吸收介质时,其光强度随吸收光介质的厚度增加呈指数减少。
I/I0=e-K1l
I0 :入射光强度; I :透射光强度;l :介质厚度;2.比尔(Beer)定律
一束单色光通过一光吸收介质时,其光强度随吸收光介质的浓度的增加呈指数减少。
I/I0=e-K2C
I0 :入射光强度; I :透射光强度;C :介质浓度 ;3.Lambert-beer’s law的合并
一束单色光通过某溶液时,光波被溶液吸收一部分,吸收多少与溶液中溶质的浓度和溶液厚度成正比。
I/I0=e-εcl
A=-lg I/ I 0=εcl
A:吸光度; C:溶液浓度; L:液层厚度
ε:即摩尔消光系数,也叫摩尔吸光度,溶液浓度为
mol/L,光程为1cm时的消光系数;4.计算
(1)标准管法(标准比较法)
实际测定过程中,用一已知浓度的测定物按测定管同样处理显色,读出吸光度,再根据前式计算。
A标准=ε标准C标准L标准
A样品=ε样品C样品L样品
A:吸光度;ε :摩尔吸光度;C:溶液浓度;L:液层厚度; 因标准液和样品液中溶质为同一物质,
ε样品= ε标准
因盛标准液和测定液的比色杯径长相同
L样品=L标准
故上二式可写成:
A标准/A样品= ε标准C标准/ ε样品C样品
C样品=A样品/A标准 × C标准;(2)标准曲线法
配制一系列已知不同浓度的测定物溶液,按测定管同样方法处理显色,分别读取各管吸光度。
以溶液浓度为横座标,吸光度为纵座标,在方格座标纸上作图得标准曲线,根据测得吸光度值从标准曲线上读得测定物的浓度。 ;标准曲线使用注意事项;5.应用中注意的问题
① Lambert-beer’s law的偏离:该定律只适应于一定浓度范围,稀溶液能很好的服从该定律,A宜在0.05~1.0之间,超过该范围→偏离→计算结果与实际浓度不相符
② 选择波长:最大吸收波长,因为a.灵敏;b.避免杂质干 扰
③ 参比溶液(空白管):消除背景效应,应包含除待测溶质以外所有的成分。; 空白管:
测量过程中,因比色皿本身和溶剂也会产生一定的光吸收,故设置一个空白管,即其中除了待测溶质以外,其它的成分完全相同。
测量时,首先以空白管对准光路对仪器调零,既消除比色皿本身对光的吸收,又消除了非待测物对光的吸收,所测值即为待测物造成的光吸收。;分光光度计;一.基本部件
1.光源 分光光度计上常用的光源有两种,即钨灯和氢灯
(或氘灯)。在可见光区,近紫外光区和近红外光区常用钨
灯;在紫外光区,多使用氢灯。
2.单色器 棱镜或光栅,把混合光分解为单一波长的光。
3.吸收池(比色皿、比色池) 选用合适的比色皿(可见
光—玻璃;紫外光– 石英;规格、新旧程度一致)
4.检测器
5.测量装置 ; 二. 分光光度计使用步骤(示教)
三. 使用时注意事项
1. 波长选择。
2. 机器预热。
3.
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